环孢霉素A是一种主要由膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum产生的环肽类次级代谢产物,临床上被广泛用作免疫抑制剂,其合成需要特殊底物(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine(Bmt),但目前相关Bmt的研究很少.基因敲除实验证实Bmt的生物合成需要一个聚酮合酶(polyketosynthase,PKS)基因(simG)参与,并推测其功能为合成 Bmt 的前体化合物羧酸分子 3(R)-hydroxyl-4(R)-methyl-6(E)-octenoic acid(B1).本研究通过在同为虫生真菌的球孢白僵菌 Beauveria bassiana中异源表达simG,以证明该基因的功能.通过克隆获得了较大基因 simG,利用根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens介导方法将该基因转化到球孢白僵菌中,通过基因检测和半定量RT-PCR筛选出目标基因表达量高的菌株,获得 4株simG高表达菌株.将其发酵培养后,利用LC-MS检测发酵产物,发现在simG高表达菌株中存在与B1分子量相同的产物峰.本研究进一步证明了simG负责化合物B1的合成,是Bmt合成的关键基因.本研究进一步加深了对环孢霉素的生物合成机理的认识,为构建Bmt高产的工程菌株提供理论支撑,有望从解决底物来源角度促进环孢霉素生产效率的提高.

琥珀酸作为一种重要的 C4 平台化合物,广泛应用于食品、化学、医药等领域.利用大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产琥珀酸受胞内辅因子不平衡的影响,存在产率低、生产强度低、副产物多等问题.为此,对不同氧气条件下琥珀酸产量和化学计量学分析发现,微厌氧条件下E.coli FMME-N-26 高效积累琥珀酸需要借助三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)为还原性三羧酸途径(reductive tricarboxylic acid pathway,r-TCA)提供足够的ATP和NADH.通过减少ATP消耗、强化ATP合成、阻断NADH竞争途径和构建NADH回补路径等代谢工程策略,组合调控胞内ATP与NADH含量,获得工程菌株E.coli FW-17.通过发酵条件优化,菌株E.coli FW-17 在 5 L发酵罐能积累 139.52 g/L琥珀酸,比出发菌株提高了 17.81%,乙酸浓度为 1.40 g/L,降低了 67.59%.进一步在 1 000 L发酵罐中进行放大实验,琥珀酸产量和乙酸浓度分别为 140.2 g/L和 1.38 g/L.

L-甲硫氨酸又名 L-蛋氨酸,是人体必需 8 种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用.以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110 ?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株 L-甲硫氨酸高产菌株.首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和 筛 选 不 同 来 源 的 丝 氨 酸 羟 甲 基 转 移 酶(hydroxymethyltransferase,GlyA),增强了一碳模块甲基供体的生成,优化了一碳模块.随后针对一碳模块的前体供应,过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY),有效地提高了 L-高半胱氨酸和 L-半胱氨酸的供应.最终摇瓶发酵 L-甲硫氨酸的产量由 2.8 g/L提高至4.05 g/L,5 L发酵罐中达到 18.26 g/L.研究结果表明,一碳模块对 L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响,在细胞内通过优化一碳模块,可以实现 L-甲硫氨酸的高效生物合成.本研究为进一步提高微生物发酵生产 L-甲硫氨酸的水平奠定了基础.

木质纤维素类生物质是前景广阔的化石原料替代品,其生物炼制可生产生物能源、生物基化学品和生物材料等多种产品,可降低碳排放,有助于实现"双碳"目标,因此受到越来越多的关注.然而,木质纤维素生物炼制需要经过预处理、微生物发酵和产物纯化等多个步骤,其中,预处理过程产生的多种化合物抑制微生物的细胞生长和发酵性能,是制约生物转化效率的瓶颈之一.大肠杆菌是木质纤维素生物炼制常用的宿主,被广泛应用于多种化合物的生产,研究其对木质纤维素水解液中抑制物的耐受性,对于提高木质纤维素生物炼制效率具有重要意义.本文首先介绍了木质纤维素的主要成分和基本结构,对木质纤维素的预处理方法以及预处理后水解液中的主要抑制物种类进行了简单阐述;随后,总结了木质纤维素水解液中几类主要抑制物呋喃类、羧酸类和酚类对大肠杆菌细胞的毒性,以及大肠杆菌对上述抑制物的胁迫响应机制和基于机制的菌株改造靶点;最后,综述了提高大肠杆菌对上述抑制物的胁迫耐受性的菌株改造策略,包括随机突变、实验室适应性进化和组学辅助的理性设计等,为利用代谢工程构建用于木质纤维素生物炼制的高效大肠杆菌菌株提供参考.

微生物在发酵生产中常面临各种酸性物质的累积,由此造成的酸胁迫严重抑制了菌株的发酵活力和生产性能.因此,微生物在长期进化过程中,通过协调胞内的多个生理系统、代谢途径和调控网络形成了复杂的响应机制以应对低pH胁迫.工业微生物酸胁迫耐受性能的强化是提高其生产效率的关键手段.本文概述了近年来利用适应性实验室进化、预适应、基因组重排、基因工程、全局转录机制工程、系统生物学和合成生物学等方法提高微生物耐酸性能的研究进展,并讨论了相关研究面临的挑战和未来的发展方向.

微生物细胞在自然环境或工业应用中经常受到酸胁迫,严重制约细胞生长性能和产物合成效率.为了在各种酸性环境中生存,耐酸细菌发展出多种保护机制来维持细胞内pH稳态,如氢离子消耗、细胞膜保护、代谢修饰等.因此,深入研究耐酸机制、改进菌株耐酸能力对于利用微生物发酵合成高附加值产品具有重要意义.作为模式微生物,大肠杆菌耐酸机制的研究较为透彻,近年来其耐酸性改造也取得了重大进展.本文主要总结了大肠杆菌的氧化或葡萄糖抑制系统(acid resistance system 1,AR1)、谷氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 2,AR2)、精氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 3,AR3)、赖氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 4,AR4)和鸟氨酸依赖型耐酸系统(acid resistance system 5,AR5)、细胞膜保护以及生物大分子修复等方面的耐酸机制,并概述了利用传统代谢工程、全局转录工程和适应性实验室进化等方法构建大肠杆菌耐酸菌株的研究进展,同时展望了大肠杆菌耐酸机制及其改造的后续研究方向.

[背景]随着代谢工程与合成生物学的快速发展,通过对异养微生物进行代谢改造,利用生物法进行二氧化碳固定成为一个新的趋势.生物代谢途径中存在着大量固碳酶,这些酶尚待挖掘与应用,不同的酶固碳效率之间也缺少比较.[目的]在体外和体内对固碳功能和效率进行评价.[方法]选取 3 种固碳酶,即核酮糖 1,5-二磷酸羧化加氧酶(ribose 1,5-diphosphate carboxylation oxygenase,RuBisCo)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase,ACC)在大肠杆菌中异源表达并纯化.测定纯酶的酶活,并建立无细胞催化实验-液质联用评价酶固碳能力的方法.在厌氧发酵条件下检测代谢指标,比较过表达固碳酶的地衣芽孢杆菌相较于原始菌的代谢差异.[结果]3 种酶均实现可溶性表达,纯酶的比酶活分别为66.43、1.16 和 12.52 U/mg.通过体外无细胞催化实验,ACC在 3 种酶中表现出最高的固碳效率.分别过表达了 PCK、ACC 的重组地衣芽孢杆菌,厌氧发酵主产物乳酸的转化率从 48.6%分别提升至 58.1%和 59.7%.[结论]可以通过体外、体内结合的方式对固碳酶的效率进行评价,该研究可为固碳酶在微生物遗传改造中理性、精准地应用提供参考.

[背景]肌醇是一种 B 族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域.微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制.毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本身含有天然的肌醇合成途径,具有被改造成为高效生产肌醇细胞工厂的潜力.[目的]通过代谢工程改造毕赤酵母工程菌株,降低副产物的生成并提高肌醇的产量.[方法]以实验室前期构建的产肌醇毕赤酵母工程菌株为出发菌株,确定副产物阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成相关基因.通过关键基因敲除、发酵液中葡萄糖浓度控制降低副产物的产量.通过过表达甘油转运蛋白、甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶基因实现产肌醇毕赤酵母对甘油和葡萄糖的共利用,得到重组菌 Z10.经过发酵条件优化,进一步提高Z10 的肌醇产量.[结果]在最优条件下,重组菌Z10 的肌醇产量达到 36.7 g/L,是目前酵母类细胞工厂生产肌醇的最高值,副产物总产量与出发菌株相比降低了 63.1%.[结论]在毕赤酵母中建立了降低阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成的有效策略,并通过甘油、葡萄糖共利用及相对应的发酵条件优化提高了肌醇产量,为肌醇及其他高价值生物活性物质在毕赤酵母中的高效生产提供了重要参考.

为明晰内生真菌在宿主植物耐盐生长中是否存在拮抗作用,探讨利用内生真菌提高困难立地条件下造林成活率的可能,将两株耐盐内生真菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria sp.)Z1(T3)、炭团菌(Hypoxylon sp.)Y6(T4)及其混合菌(T2)进行固体发酵培养,添加到栽植有木麻黄(Casuarina equisetifolia)幼苗的不同盐度(质量分数为0、3‰、6‰、9‰)盆钵土壤中,以添加菌株载体(T1)和无添加(CK)为对照,研究固体培养内生真菌对土壤盐胁迫下木麻黄幼苗抗逆生理特征的影响及其与生物量的关系.结果表明:菌株处理显著提高了盐胁迫下幼苗的生物量,幼苗生理特征受土壤盐度、时间和菌株种类影响较大.3‰盐度下,T2处理15天后可溶性糖(SS)含量、可溶性蛋白(SP)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及45天后过氧化氢酶(CAT)活性高于CK、T1,相对电导率(REC)在T2、T3和T4处理胁迫期都显著降低;9‰盐度下,T2、T3和T4处理实验期内REC、H2O2含量显著降低,胁迫60天后丙二醛(MDA)含量显著降低,SS含量、SOD活性、CAT活性显著增加,T2处理的SP含量、过氧化物酶(POD)活性同样显著增加.采用逐步回归建立了菌株处理下幼苗生理特征与生物量关系的回归方程模型,通径分析表明REC、POD活性和SS含量为影响生物量的主要生理因素.综上,不同菌株对幼苗渗透调节物质含量、氧化酶活性和生物量的影响不同,混合菌的拮抗作用最为明显,研究结果初步揭示了盐胁迫下木麻黄渗透调节物质含量、抗逆酶、生物量与木麻黄内生真菌的关系,为木麻黄抗逆工程菌的发掘提供了研究基础.

Mig1和Snf1是酿酒酵母葡萄糖阻遏效应的两个关键调控因子.为了提高酿酒酵母工程菌同时利用葡萄糖和木糖的能力,分别对MIG1和NF1基因进行了单敲除和双敲除,并通过摇瓶发酵实验和RNA-Seq转录组分析,初步揭示了Mig1和Snf1可能影响葡萄糖和木糖共利用表达差异基因的层级调控机制.研究结果表明,MIG1单敲除对混合糖的共利用影响不大;SNF1单敲除会加快混合糖中木糖的利用而且葡萄糖和木糖可以被同时利用,这可能归因于SNF1单敲除会解除对一些氮分解代谢阻遏基因表达的抑制,从而促进了细胞对氮源营养的利用;进一步敲除MIG1,会解除更多氮分解代谢阻遏基因表达的抑制,以及一些碳中心代谢途径基因表达上调.虽然MIG1和SNF1双敲除菌株利用葡萄糖加快而利用木糖变慢,但是葡萄糖和木糖可以被同时利用,进而加快乙醇的积累.综上所述,MIG1和SNF1的敲除导致氮分解阻遏基因表达上调,有助于促进葡萄糖和木糖的共利用;解析Mig1和Snf1对氮分解阻遏基因的层级调控作用,为进一步提高葡萄糖和木糖的共利用提供新的靶点.