通过高通量药物库筛选挖掘针对金黄色葡萄球菌（ S. aureus，简称：金葡）的新型抗菌药物。本研究的类型为实验性研究。金葡临床菌株均于2017年1月至2019年1月分离自中南大学湘雅三医院呼吸科住院患者的痰液标本；通过摇菌培养浮游菌，检测美国食品药品监督管理局（FDA）认证药物库（包含1573种小分子）对金葡浮游菌增殖抑制作用；通过96孔板结合结晶紫染色，检测FDA认证药物库分子对金葡生物被膜形成的抑制作用；通过微量肉汤稀释实验，检测纳入小分子的最低抑菌浓度（MIC）；最后，通过CCK-8实验检测小分子药物的细胞毒性。结果显示，通过将FDA认证药物库中的小分子浓度设置为100 μmol/L，初步筛选出218种对金葡浮游菌具有生长抑制作用的小分子。这些小分子以抗感染药物为主，占118种。其次为抗肿瘤药物、抗炎/免疫类药物、神经系统药物、心血管系统药物、内分泌系统药物和代谢疾病药物，分别占40、19、12、9、8和3种，未分类药物占9种。排除抗感染药物后，针对具有金葡浮游菌生长抑制作用排名前十的小分子主要为抗肿瘤药物，其次为神经系统药物和未分类药物维生素K3，其抑制率均达99.65%~100%。针对具有金葡生物被膜抑制作用的排名前十小分子也以抗肿瘤药物占比最高，其次为神经系统药物和抗炎/免疫类药物，其抑制率为50.22%~92.95%。通过微量肉汤稀释实验检测了第二轮筛选得到的51个小分子的MIC。其中，主要包括抗肿瘤药物、心血管系统药物、内分泌系统药物、抗炎/免疫药物、代谢疾病药物、神经系统药物和其他未分类药物，分别占22、5、3、9、2、5和5种，其MIC分布分别为1.56~50 μmol/L、6.25~25 μmol/L、6.25~25 μmol/L、0.2~50 μmol/L、25~50 μmol/L、1.56~50 μmol/L和0.1~12.5 μmol/L。综上，通过高通量药物库筛选出的小分子最低抑菌浓度值均为微摩尔级别，成药能力强且可改造性高。其高效的浮游菌和生物被膜抗菌作用有望为针对金葡的新药研发提供新的思路。

通过自杀质粒介导的同源重组方法将绿色荧光报告基因（GFP）标记至含 mcr-1基因多黏菌素耐药质粒pSH13G841上，形成可发出绿色荧光的质粒pSH13G841-GFP；通过改造大肠J53菌株，构建带有红色荧光报告基因（RFP）标记的大肠杆菌J53-RFP。随后利用pSH13G841-GFP自发接合的能力，将pSH13G841-GFP质粒转化入J53-RFP菌体中，构建出双荧光标记的耐药质粒供体菌模型，能够稳定且自发地发出红色荧光和绿色荧光。构建的双荧光标记系统可用于耐药质粒水平转移的可视化追踪，为动态监测耐药基因 mcr-1在生物体内的接合转移规律提供了可能。

启动子是调控转录起始的最基本元件,对原核生物的生存和适应至关重要.深入研究原核生物的启动子有助于了解原核生物的基因表达调控机制,有利于构建智能和高效的工程菌株,进而有利于提高重要代谢物的产量,在合成生物学和代谢工程等领域均具有重要意义.近年来,随着原核生物启动子研究成果的不断积累,大量启动子的序列被克隆、鉴定以及改造,并被尝试用于生产实践.本文介绍了原核生物启动子的结构和类型,详述了启动子预测、结构分析、功能鉴定及其开发应用的方法,最后对该领域的研究进行展望,以期为筛选和鉴定新型原核生物启动子、提高靶基因的高效表达及优化代谢途径提供思路.

目的:对嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)来源的谷胱甘肽双功能合成酶(glutathione bifunctional synthetase,GshF)在大肠杆菌(Escherichia coli)进行表达,对 GshFst 进行定点突变,得到酶活和稳定性有所提高的突变株,并对突变株全细胞催化条件进行优化.方法:选择6种不同的表达载体表达,获得最优表达载体后利用单因素试验进行诱导条件的优化,在此基础上,利用AlphaFold2对GshFst进行建模和分子对接,通过预测得到突变位点,经单点突变及组合突变,获得优势突变体,并对催化条件进行优化.结果:GshF在大肠杆菌中成功表达,获得了突变体GshFstL136K/V498C,其比酶活为12.03 U/mg,较野生型提高了 86.80％,在37℃的半衰期为134.24 min,较野生型提高了 40.95％.以GshFstL136K/V498C为出发菌株,采用单因素试验对全细胞催化条件优化,得到的最佳催化条件是:生物量OD600=30,反应温度40℃,反应pH 9.0,缓冲液Tris-HCl 50 mmol/L、L-谷氨酸 40 mmol/L,L-半胱氨酸 25 mmol/L,甘氨酸 40 mmol/L,ATP 25 mmol/L,催化3 h后,GSH浓度可以达到24.17 mmol/L,底物L-半胱氨酸的转化率约为96.68％.结论:筛选到了适合GshFst的表达载体及诱导表达条件,对GshFst进行半理性改造提高了其催化活性和稳定性,通过优化获得了全细胞催化合成GSH的工艺.

[目的]为实现生物合成重要化合物 2-萘乙醇,探索利于 2-萘乙醇合成的基因组合.[方法]向酿酒酵母BY4741发酵液中外源添加 2-萘丙氨酸,运用高效液相色谱法进行产物检测;绘制BY4741 的生长曲线和产量曲线,添加不同浓度 2-萘丙氨酸到BY4741 发酵液中并检测BY4741 生长和生产情况;对BY4741 进行代谢工程改造,构建过表达Ehrlich途径 6 个基因的质粒并转化进BY4741 中;发酵 6 株改造菌株,检测产物产量.[结果]发酵液中检测到了推测产物 2-萘乙醇,代谢工程改造菌株相较于野生型BY4741 菌株产量均有所提升,其中过表达ARO9和ARO10基因使得 2-萘乙醇的产量在外源添加 1 mmol/L 2-萘丙氨酸的情况下达到 0.258 mmol/L,转化率达到野生型的 2.3 倍.[结论]在酿酒酵母中实现了 2-萘乙醇的生物合成,探索出ARO9 和ARO10 是利于 2-萘乙醇生物合成的基因组合,为工业生产 2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法.

丙谷二肽(L-alanyl-L-glutamine,Ala-Gln)是一种重要的二肽,其在体内可分解为L-谷氨酰胺(L-Gln),该氨基酸具有不可替代的生理生化作用.传统化学法合成Ala-Gln存在污染高、转化率低、纯度低等缺点,并伴随有毒副产物产生,这限制了其规模化应用.随着生物学的快速发展,研究者们解析了 Ala-Gin的合成方式,并对菌株进行了定向改造,为绿色高效生产Ala-Gln开启了新纪元.主要对Ala-Gln的应用、传统化学法和生物法合成Ala-Gln的研究进展进行综述,旨在探索如何利用合成生物学、基因组学等学科技术改造Ala-Gln的代谢途径,高效生产Ala-Gin,为Ala-Gln产业化提供理论基础.

灵菌红素是一种天然的红色三吡咯色素,主要源自于微生物的次级代谢过程,其具有抗菌、抗肿瘤等功能,在医药、环境、染料等领域具有广阔的应用前景.随着合成生物学技术的不断发展,利用微生物发酵法合成灵菌红素是实现灵菌红素工业化生产的有效途径之一.目前,生产灵菌红素的微生物主要以粘质沙雷氏菌为主.本文系统介绍了灵菌红素的结构性质和应用潜力,重点阐述了粘质沙雷氏菌中灵菌红素的合成路径,总结了通过高产菌株选育与改造、发酵工艺优化和转录因子调控等策略提高灵菌红素合成的最新研究进展,分析了不同提取纯化工艺的效率,并对未来灵菌红素的高效合成进行了展望,以进一步提高灵菌红素的工业化生产效率.

[目的]探究与挖掘不同生长时期谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中潜在的小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA).[方法]检测不同时期和不同工业改造的谷氨酸棒杆菌菌株的RNA-Seq数据构建表达文库,通过sRNA-Detect和APERO两种方法构建潜在的sRNA数据库.以逆转录PCR检测(real-time reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测sRNA的表达,并通过生物信息学方法分析潜在sRNA的调控位点、二级结构及保守结构域.[结果]构建了包含2 653条潜在sRNA的数据库,依据其相较于编码序列(coding sequence,CDS)区域的位置进行分类、预测功能.发现了在高GC革兰氏阳性菌中普遍存在的sRNA00130,随生长时期表达量变化的sRNA00257,常时高表达的sRNA02036、sRNA02037等sRNA.依据自由结合能预测潜在sRNA可能的结合位点、二级结构,预测结果显示潜在的sRNAs同多种细胞复制、代谢通路基因相关.大多数潜在sRNA仅在谷氨酸棒杆菌中具有保守性.[结论]谷氨酸棒杆菌潜在sRNA的发掘对于填补谷氨酸棒杆菌生长调控机制的空缺具有重要作用,提供了新的可能的调控工具与改造位点.

电活性微生物奥奈达希瓦氏菌的胞外电子传递(extracellular electron transfer,EET)在污染物降解、环境修复、生物电化学传感、能源利用等方面具有广泛的应用潜力;四血红素细胞色素CctA(small tetraheme cytochrome)是希瓦氏菌周质空间中最丰富的蛋白质之一,能够参与多种氧化还原过程,但目前对CctA在EET中的行为和机理认识仍然有限.[目的]研究阐明CctA蛋白在希瓦氏菌模式菌株MR-1周质空间以偶氮染料作为电子受体的EET中的作用,补充和拓展希瓦氏菌的厌氧呼吸产能机制.[方法]以周质还原型偶氮染料甲基橙(methyl orange,MO)作为电子受体,在mteal reduction(Mtr)蛋白缺失菌株△mtr中研究MO的周质还原特点,并通过基因敲除和回补表达研究CctA蛋白在周质电子传递中的作用.[结果]在缺失Mtr通道的情况下,细胞色素CctA可以介导周质空间的电子传递而还原MO.重组表达CctA在低水平时,MO在周质空间中的还原速率与其表达水平呈正相关,更高水平的CctA表达无助于进一步提高MO的还原速率.蛋白膜伏安结果展示了 CctA与周质空间内其他高电位氧化还原蛋白的显著区别,可能参与构成一条低电位的MO还原通道.[结论]从分子动力学层面揭示了 CctA在周质MO还原中的独特电子传递行为,为进一步推进对细菌周质电子传递机制的理解,以及通过合成生物学设计或改造胞外氧化还原系统、强化生物电化学在污染物降解中的应用提供了重要信息.

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好.然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分.此外,随着产物 γ-氨基丁酸的生成,溶液 pH 会逐渐上升,不利于 GAD 酶的持续转化.本研究首先从实验室保藏的一株高产 γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择 9 个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体 LpGADS24R/D88R/Y309K在催化 pH 区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍.接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理.此外,将Lpgad与LpgadS24R/D88R/Y309K突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01 中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40℃,菌体量OD600=20,底物L-谷氨酸 100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为 100 μmol/L.5 L发酵罐中,不调节 pH,通过分批投料底物 L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达 402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍.本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础.