目的:探讨叉头状转录因子O3（FOXO3）在小鼠肝脏糖代谢中的作用。方法:将雄性肝脏激活蛋白（LAP）启动子控制下且表达四环素调节的反式激活因子（tTA）的转基因小鼠（LAP-tTA小鼠）与雌性荧光素酶-tet操作元件（tetO）7-FOXO3的组成型活性等位基因小鼠［（tetO）7.FOXO3CA小鼠］杂交，获得FOXO3CA hep小鼠（tTA +/FOXO3CA +，肝脏FOXO3条件性高表达，7只）。以tTA -和（或）FOXO3CA -小鼠作为对照组（9只）。通过IVIS活体成像、实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blotting以及免疫组化检测各组小鼠肝脏FOXO3表达情况，RT-qPCR检测相关糖异生基因［葡萄糖6-磷酸酶（ G6pc）、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（ Pepck）、丙酮酸脱氢酶激酶4（ Pdk4）］的mRNA水平。监测小鼠血糖、血清胰岛素，并进行葡萄糖耐量实验以及胰岛素耐量实验。利用免疫组织化学染色评估胰腺胰岛增生、胰岛素以及胰高血糖素表达。组间比较采用 t检验。 结果:IVIS活体成像、RT-qPCR、Western blotting以及免疫组化证实FOXO3CA hep小鼠肝脏FOXO3高表达，且主要表达于肝细胞核内，FOXO3高表达导致肝细胞体积明显小于对照组肝细胞。与对照组相比，7周龄FOXO3CA hep小鼠的空腹血糖水平显著升高［分别为（165.7±24.1）和（87.4±12.1）mg/dl， P<0.001］，糖异生基因 G6pc、 Pepck、 Pdk4的mRNA水平显著增加（均 P<0.001）。与对照组相比，9周龄FOXO3CA hep小鼠空腹血糖下降［分别为（55.6±6.1）和（82.8±17.2）mg/dl， P=0.001］，胰岛素水平显著升高［分别为（10.01±1.56）和（1.50±0.82）ng/ml， P<0.001］。免疫组织化学染色结果提示，FOXO3CA hep小鼠较对照组胰岛细胞显著增生，胰岛细胞呈现胰岛素强阳性，胰岛素耐量实验提示存在胰岛素抵抗。 结论:FOXO3持续高表达可促进肝脏糖异生相关基因的上调、血糖紊乱和胰岛素水平升高、胰岛增生及胰岛素抵抗。

目的:探讨慢加急(亚急)性肝衰竭(ACLF)患者以及氧化应激损伤大鼠肝细胞沉默信息调节因子6(SIRT6)和糖异生限速酶表达的变化以及可能机制。方法:选取2016年8月至2018年5月首都医科大学附属北京佑安医院10例ACLF患者纳入ACLF组，10例正常肝移植供者纳入正常对照组。收集入选者空腹血糖、总胆红素、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等资料。分离Sprague Dawley大鼠肝细胞，分为对照组(无任何干预)、模型组(H 2O 2干预6 h)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活组(模型组基础上加入mTOR激活剂)、mTOR抑制组(模型组基础上加入mTOR抑制剂)。蛋白质电泳和聚合酶链反应检测葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、SIRT6以及mTOR的相对表达。 结果:ACLF组ALT、总胆红素高于正常对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。ACLF组SIRT6含量(0.15±0.07)μg/L、空腹血糖(3.19±0.59)mmol/L，明显低于正常对照组(0.46±0.15)μg/L、(7.07±2.07)mmol/L，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。ACLF组肝组织PEPCK、G6P蛋白相对表达明显低于正常对照组。模型组SIRT6、PEPCK、G6P mRNA相对表达低于对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。激活mTOR后PEPCK、G6P、SIRT6相对表达高于模型组，抑制mTOR后PEPCK、G6P、SIRT6相对表达低于模型组。 结论:ACLF时SIRT6可能与mTOR信号途径相互作用，抑制糖异生，并与低血糖的发生相关，降低SIRT6水平，可能起到延缓ACLF进展的作用。

目的:探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)在小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及迁移中的作用及机制.方法:用30 μg/L血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导小鼠VSMCs增殖和迁移,将小鼠VSMCs分为溶剂对照(vehicle)组和PDGF-BB组,采用Western blot和免疫荧光染色检测PCK1表达水平的变化.使用小鼠Pck1 siRNA(si Pck1)转染小鼠VSMCs沉默PCK1表达,将VSMCs分为vehicle组、si Pck1+vehicle组、PDGF-BB组和si Pck1+PDGF-BB组,采用免疫荧光染色检测细胞增殖能力,CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,透射电镜观察细胞线粒体动力学变化.发动蛋白相关蛋白1(Drp1)基因过表达慢病毒(lenti-Drp1)转染VSMCs使DRP1过表达,将小鼠VSMCs分为PDGF-BB组、si Pck1+PDGF-BB组、lenti-Drp1+PDGF-BB组和lenti-Drp1+si Pck1+PDGF-BB组,再次检测上述指标.结果:PDGF-BB使VSMCs中PCK1和DRP1表达增加,细胞活力升高,Ki-67阳性细胞率增加,划痕愈合率升高,线粒体分裂增加;沉默PCK1表达后以上过程均受到抑制.过表达DRP1后,沉默PCK1表达对VSMCs细胞活力、Ki-67阳性细胞率、划痕愈合率和线粒体分裂的抑制作用明显削弱.结论:PCK1通过调控DRP1表达促进小鼠VSMCs线粒体分裂、细胞增殖和迁移.

目的 研究固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP1c)对肠道糖异生的调控作用.方法 饥饿处理C57BL/6小鼠、SREBP1c纯合敲除型(SREBP1c-KO)和同窝野生型(SREBP1c-WT)小鼠,通过qPCR、Western blot检测糖异生途径限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase catalytic,G6PC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1)在肝脏、空肠和回肠组织中的表达水平;在肠上皮细胞CaCo-2中过表达或敲低SREBP1c,检测细胞内G6PC和PCK1表达水平.结果 饥饿处理后,C57BL/6小鼠空肠、回肠组织中G6PC、PCK1和SREBP1c表达水平均显著增加(P<0.05).SREBP1c基因敲除后,小鼠空肠、回肠组织中由饥饿诱导的糖异生限速酶G6PC和PCK1的表达明显下调(P<0.05).在肠上皮细胞CaCo-2中过表达SREBP1c,可显著上调糖异生途径关键酶G6PC和PCK1的表达,促进细胞内葡萄糖的产生(P<0.05);反之,敲低SREBP1c的表达,可明显下调G6PC和PCK1,抑制细胞内葡萄糖的产生(P<0.05).结论 饥饿状态下,SREBP1c可调控肠上皮细胞中糖异生限速酶G6PC和PCK1的表达,进而影响葡萄糖的生成,表明SREBP 1 c可能参与肠道糖异生的调控,机制有待进一步探索.

背景:白藜芦醇是从植物中提取而来的天然抗氧化剂,其改善运动性疲劳的机制主要集中在氧化应激和炎症反应的保护作用上,此次研究主要从糖异生角度探讨其对运动性疲劳的保护机制.目的:探讨白藜芦醇对运动性疲劳大鼠糖异生的影响.方法:SD雄性大鼠适应性训练1周后随机分为4组,即空白对照组、白藜芦醇组、运动组、白藜芦醇+运动组,每组12只.空白对照组和白藜芦醇组正常饲养,不进行游泳训练;白藜芦醇+运动组和运动组采用负重游泳训练模拟长时间中高强度运动,每天负重5%游泳1 h后,分别灌胃50 mg/kg的白藜芦醇溶液或等体积的二甲基亚砜溶剂,每周6 d,共6周.末次运动后24 h取材,试剂盒检测尿素氮、肌酸激酶、血糖、肝糖原以及肝脏组织中乳酸、丙酮酸水平;微量法检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性,酶联免疫吸附法检测葡萄糖-6-磷酸酶活性;RT-PCR检测SIRT1、CREB和PGC-1α的基因表达水平.结果与结论:①运动组大鼠血浆尿素氮和肌酸激酶水平明显升高(均P<0.05),肝脏乳酸、丙酮酸水平和乳酸/丙酮酸比值明显升高(均P<0.01),血糖和肝糖原水平明显降低(均P<0.01);补充白藜芦醇可有效改善以上情况;②运动使大鼠肝脏组织糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性明显降低(P<0.01,P<0.05),补充白藜芦醇可明显提高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性(P<0.01);③运动组肝脏组织SIRT1、CREB和PGC-1α的mRNA表达水平明显降低(均P<0.01),补充白藜芦醇可使该通路基因表达水平明显升高;④提示白藜芦醇能缓解长时间中高强度运动导致的运动性疲劳,其机制可能与上调糖异生调控通路、提高限速酶活性、促进肝脏糖异生、升高血糖和肝糖原水平有关.

[背景]随着代谢工程与合成生物学的快速发展,通过对异养微生物进行代谢改造,利用生物法进行二氧化碳固定成为一个新的趋势.生物代谢途径中存在着大量固碳酶,这些酶尚待挖掘与应用,不同的酶固碳效率之间也缺少比较.[目的]在体外和体内对固碳功能和效率进行评价.[方法]选取 3 种固碳酶,即核酮糖 1,5-二磷酸羧化加氧酶(ribose 1,5-diphosphate carboxylation oxygenase,RuBisCo)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase,ACC)在大肠杆菌中异源表达并纯化.测定纯酶的酶活,并建立无细胞催化实验-液质联用评价酶固碳能力的方法.在厌氧发酵条件下检测代谢指标,比较过表达固碳酶的地衣芽孢杆菌相较于原始菌的代谢差异.[结果]3 种酶均实现可溶性表达,纯酶的比酶活分别为66.43、1.16 和 12.52 U/mg.通过体外无细胞催化实验,ACC在 3 种酶中表现出最高的固碳效率.分别过表达了 PCK、ACC 的重组地衣芽孢杆菌,厌氧发酵主产物乳酸的转化率从 48.6%分别提升至 58.1%和 59.7%.[结论]可以通过体外、体内结合的方式对固碳酶的效率进行评价,该研究可为固碳酶在微生物遗传改造中理性、精准地应用提供参考.

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A (NS5A)及其片段NS5A结构域Ⅰ、结构域Ⅱ、结构域Ⅲ调节小鼠糖异生的机制.方法 60只C57BL/6J雄性小鼠随机分为6组,分别将小鼠肝细胞特异性表达重组全长NS5A蛋白及其片段NS5A结构域Ⅰ、结构域Ⅱ、结构域Ⅲ的慢病毒颗粒经C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射制备动物模型,以未注射组和注射增强绿色荧光蛋白慢病毒颗粒组为阴性对照.检测全长NS5A蛋白及其片段对小鼠空腹血糖及空腹胰岛素水平的影响;取小鼠肝组织制备石蜡切片,免疫组织化学方法检查小鼠肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达水平;实时荧光定量PCR (qRCR)和(或)Western blot方法检测小鼠肝组织NSSA、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和PEPCK的表达水平.结果 与未注射组(0.65±0.28)和(或)注射EGFP慢病毒颗粒组(0.87±0.36)相比,注射重组全长NS5A (1.79±0.64)和NS5A结构域(2.24±0.69)Ⅱ慢病毒颗粒的小鼠空腹血糖和胰岛素抵抗指数明显升高(P＜ 0.01);免疫组织化学和qRCR检测显示糖异生的关键酶PEPCK的表达量明显增多;Western blot检测结果显示NS5A蛋白和NS5A结构域Ⅱ抑制了磷酸化AMPK (Thr172)的水平、提升了SREBP-1和PEPCK的水平.结论 NS5A蛋白和NS5A结构域Ⅱ可能通过调节AMPK/SREBP-1/PEPCK而影响小鼠肝细胞糖代谢,NS5A结构域Ⅱ可能在HCV感染引起肝细胞胰岛素抵抗中起重要作用.

目的 观察黄秋葵醇提物中槲皮素和异槲皮苷对肝细胞糖异生及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6 Pase)的影响,并探讨其机制.方法 体外培养小鼠原代肝细胞,以乳酸和丙酮酸为糖异生底物.予不同浓度槲皮素、异槲皮苷干预24 h后,葡萄糖氧化酶法测定培养液上清葡萄糖浓度,RT-PCR法检测PEPCK、G6Pase、AMPKα mRNA表达,Western blot法检测总AMPKα、AMPKα Thr172磷酸化水平.结果 与空白组比较,糖异生诱导组上清葡萄糖浓度显著升高(P＜0.01);槲皮素和异槲皮苷干预后,80 μmol/L槲皮素组、异槲皮苷组显著低于糖异生诱导组(P＜0.01);糖异生诱导组PEPCK、G6Pase AMPKα mRNA相对表达显著升高(P＜0.01);80 μmol/L槲皮素组、异槲皮苷组PEPCK、G6Pase表达显著低于糖异生诱导组(P＜0.05).Western blot显示,80 μmol/L槲皮素组、异槲皮苷组AMPKα Thr172磷酸化水平均较糖异生诱导组增加.结论 黄秋葵醇提物中槲皮素和异槲皮苷呈剂量依赖性地抑制体外培养原代肝细胞糖异生及其关键酶基因转录,AMPKα Thr172磷酸化可能与两者抑制糖异生机制有关.

目的 观察内脏脂肪素(visfatin)对糖尿病小鼠肝脏蛋白激酶B(AKT)、叉头转录因子1(FoxO1)及磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)表达的影响,探讨visfatin在肝组织糖异生过程中的作用.方法 16只C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组及饮食诱导高脂组,24只KKAy小鼠随机分为糖尿病模型组、visfatin组及visfatin+ LY294002组,分别予PBS、PBS、PBS、visfatin(6μg/kg,0.05mL/10g)、visfatin(6μg/kg,0.05 mL/10g)+LY294002(0.35 μg/g,0.05 mL/10g)干预3d后,测定血糖、血脂及胰岛素,计算HOMA-IR,RT-PCR测定肝组织AKT、FoxO1、PEPCK的mRNA表达,免疫组化测定肝脏组织AKT、FoxO1蛋白表达.结果 糖尿病模型组AKT mRNA及蛋白表达较正常对照组及高脂组均显著降低(P＜0.01),FoxO1mRNA及其蛋白、PEPCK mRNA表达较正常对照组均显著增高(P ＜0.01);visfatin组AKT mRNA及蛋白表达较糖尿病模型组显著增高(P＜0.05),FoxO1 mRNA及其蛋白、PEPCK mRNA表达较糖尿病模型组均显著降低(P＜0.01);visfatin+ LY294002组AKT mRNA及蛋白表达较visfatin组显著降低(P＜0.01),FoxO1蛋白表达较visfatin组显著增高(P＜0.05).结论 Visfatin可能通过PI3 K/AKT途径调节FoxO1的表达,参与到肝组织糖异生过程中.

目的 了解过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pck1)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在高尿酸血症导致胰岛细胞凋亡中的作用.方法 用普通饮食喂养雄性敲除尿酸氧化酶自发高尿酸血症小鼠(SCD-KO,n=7)及对照野生型小鼠(SCD-WT,n=7),18周时进行葡萄糖耐量试验(GTT),20周时行胰岛素耐量试验(ITT),并检测血清中的尿酸(UA)和空腹胰岛素(FINS)水平,TUNEL染色检测各组胰岛细胞凋亡情况,苏木精-伊红(HE)染色观察胰腺细胞的结构及形态,Western blot和RT-PCR方法检测各组胰腺组织中PPAR-γ 、Pck1、mTOR蛋白和mRNA表达水平.结果 实验前后SCD-KO组小鼠的UA水平显著高于SCD-WT组(t=20.67、22.60,P<0.01);SCD-WT组与SCD-KO组空腹血糖(FBG)、FINS实验前后差异无显著性(P>0.05).GTT结果显示,SCD-KO组15、30 min时血糖水平较SCD-WT组显著升高(t=2.20、2.30,P<0.05),15 min时SCD-KO组胰岛素水平较SCD-WT组低(t=6.70,P<0.05).GTT结果显示,两组FINS敏感性差异无显著性(P>0.05).HE染色显示,SCD-KO组胰腺细胞的损害程度较SCD-WT组重.与SCD-WT组比较,SCD-KO组细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(t=2.30,P<0.05).SCD-KO组PPA R-γ 、Pck1、mTOR mRNA和蛋白的相对表达量均较SCD-WT组升高(t=2.85~6.61,P<0.05).结论 PPAR-γ-Pck1-mTOR信号通路可能参与了高尿酸血症导致胰岛细胞凋亡的过程.