[目的]通过米曲霉中异源表达虫草素合成关键基因,构建米曲霉工程菌株合成虫草素.[方法]以米曲霉尿苷/尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型菌株AoΔpyrGΔHisB为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对虫草素合成关键基因CmCns1-CmCns3 进行过表达;通过荧光显微镜观察CmCns1 和CmCns2 在米曲霉中的亚细胞定位;利用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因米曲霉虫草素含量,同时对米曲霉发酵液添加合成虫草素的前体甘氨酸和腺嘌呤,探究其在米曲霉中对合成虫草素的影响.[结果]蛹虫草CmCns1 和CmCns2 在米曲霉中定位于脂滴;并且米曲霉中单独过表达CmCns1、共表达CmCns1 和CmCns2 以及共表达CmCns1-CmCns3 均能合成虫草素,发酵 48 h虫草素胞外产量最高达到 37.74 μg/mL;向米曲霉发酵液添加甘氨酸和腺嘌呤,不能有效提升虫草素的含量.[结论]成功在米曲霉异源表达合成虫草素.

目的 寻找能产生免疫抑制剂多球壳菌素(myriocin)的蝉虫草或其寄生真菌.方法 选取蝉虫草原药材大蝉草和蝉花干燥品,蝉花寄生真菌蝉棒束孢菌(Cordyceps cicadae或Isaria cicadae Miq.BNCC114807)以及一种线虫草属蝉寄生真菌Ophiocordyceps sp.FU30231,通过聚合酶链式反应(PCR)法扩增内源转录间隔区(ITS)序列,鉴定各材料的菌种;分别以乙醇回流提取法和80%甲醇浸提法制备虫生真菌发酵液,并进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析;以多球壳菌素标准品为对照,寻找生产多球壳菌素的虫生真菌;通过大量发酵和分离鉴定多球壳菌素,最终确定其产源虫生真菌.结果 ITS序列分析表明,蝉虫草原药材大蝉草和蝉花的寄生真菌分别为奇异弯颈霉(Tolypocladium paradoxum)和蝉棒束孢菌.提取液LC-MS分析结果表明,仅Ophiocordyceps sp.FU30231中检测到多球壳菌素的产生.大量发酵并分离纯化后,采用核磁谱鉴定确证了Ophiocordyceps sp.FU30231产多球壳菌素的能力.结论 Ophiocordyceps sp.FU30231首次被鉴定为免疫抑制剂多球壳菌素的生产菌株.

虫草菌粉是从新鲜冬虫夏草中分离得到菌丝体经发酵培养而得,近年来因其显著的药理活性而受到广泛关注.虫草菌粉中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉2种菌丝体的化学成分和药理活性具有明显差异,通过对二者的研究进展进行较为全面客观的文献整理分析,以期为虫草菌粉的进一步研究和开发利用提供参考.

目的:比较不同种类及产地虫草多糖的单糖组成与比例.方法:采用纤维素薄层板,以乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水(7.0∶3.0∶0.2∶1.4)为展开剂分离多糖水解后的单糖组分,苯胺-邻苯二甲酸显色后采用薄层扫描仪于410 nm波长下扫描定量.结果:6个单糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖和鼠李糖)线性关系良好(r＞0.995 7),检测限、定量限分别为0.02～0.10 μg和0.08～0.40 μg,方法具有良好的精密度、重复性和稳定性,RSD分别为3.1％～8.4％、2.3％～6.3％和0.66％～2.4％;平均回收率在94.0％和103.8％之间.不同种类虫草多糖均主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成,其中多数天然虫草及人工培养蛹虫草子实体样品中葡萄糖含量相对较高,葡萄糖与半乳糖含量的平均比值分别为5.2∶1和1.9∶1,葡萄糖与甘露糖含量的平均比值分别为16.9∶1和5.9∶1;不同人工发酵虫草菌粉样品中葡萄糖与半乳糖含量的平均比值为0.96∶1,葡萄糖与甘露糖含量的平均比值为2.0∶1;而古尼虫草、凉山虫草、亚香棒虫草、细虫草及蝉花样品中葡萄糖平均含量较低,葡萄糖与半乳糖含量的平均比值为0.31∶1,葡萄糖与甘露糖含量的平均比值为0.81∶1.结论:不同种类虫草多糖其单糖比例存在一定差异,此特征有利于对不同种类虫草质量的控制.

目的:建立一种快速分析发酵虫草菌丝粉中挥发性成分的方法,并用于不同菌种发酵虫草产品的鉴别和特征性成分的寻找.方法:利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME/GC-MS)技术测定发酵虫草菌丝粉的挥发性成分,在优化萃取头、萃取温度、吸附时间、预平衡时间和解吸时间等萃取条件的基础上,建立发酵虫草菌丝粉的HS-SPME/GC-MS测定方法,用峰面积归一化法计算各成分的相对含量,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)2种化学计量学方法对数据进行分析.结果:最佳萃取条件为DVB/CAR-PDMS萃取头、萃取温度90℃、吸附时间80 min、预平衡时间40 min、解析时间2min.利用建立的HS-SPME/GC-MS方法从金水宝胶囊、百令胶囊、宁心宝胶囊、至灵胶囊和心肝宝胶囊5种发酵虫草制剂中分别鉴定出56、71、72、81和75个化合物,主要包括酯类、醇类、羧酸类、醛类、烃类、酮类、杂环类化合物等.通过化学计量学方法对HS-SPME/GC-MS数据进行处理,实现了不同发酵虫草制剂和伪品的鉴别,并寻找到5种发酵虫草产品中的特征挥发性成分,分别为马索亚内酯、吡嗪酰胺、2-吡咯烷酮、棕榈酸乙酯和棕榈酸.结论:HS-SPME/GC-MS方法可用于发酵虫草产品中挥发性成分的快速分析.结合化学计量学方法对不同发酵虫草制剂进行鉴别和差异性成分寻找,为特征性指标成分的确定提供了一条新思路,为发酵虫草制剂质量标准的制定和提升提供了科学依据.

对22株蛹虫草Cordyceps militaris的ITS序列进行分析,并基于拆分网络法splits networks,分析供试菌株的亲缘关系,再进一步比较供试菌株发酵产虫草素能力,筛选出高产虫草素菌株.结果表明,22株蛹虫草的ITS序列长度在518-539 bp之间,对位排列后有39个差异位点,其中有12个简约信息位点,并且都发生在ITS1区;构建的拆分网络显示22株虫草聚为3个类群,每个类群因其特有的碱基替换而区别于其他菌株;22株蛹虫草发酵产虫草素性能差异很大,且虫草素主要存在于胞外液中,MF27的胞外液虫草素含量为332.74 mg/L,显著高于其它菌株(P<0.05).本研究为研究蛹虫草菌株间的系统关系和种质资源管理提供了依据.

目前市场上已获得药品批准文号的发酵虫草菌类产品包括5种发酵虫草菌粉原料药及其相关制剂.由于原料药的起始菌株均为从天然冬虫夏草中分离而来,它们的名称和化学成分类似,临床作用也较为相近.但因其菌种和发酵工艺不同,质量具有明显的差异性,临床应用也各有侧重,故在使用中应予以明确区分.该类产品的研究开发多在20世纪80-90年代,不同产品的质量标准差异较大,部分产品质量控制水平较低.且目前发酵虫草菌类产品存在同时按化学药批准文号和中药批准文号管理的情况,其名称使用、监管和临床应用也较为混乱.该文通过对发酵虫草菌类产品的批准文号类别、质量标准及应用情况进行比较和梳理,总结了该类产品的标准情况和存在问题,提出规范产品名称、统一文号管理类别、增加专属性质量控制内容等相关建议,以期对发酵虫草菌粉及相关制剂的标准执行、质量控制以及药品监管提供参考.

目的:将发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖进行分离纯化,并观察纯化产物对ConA抑制人正常肝细胞(L-O2细胞株)增殖活性的拮抗作用.方法:发酵虫草菌粉(Cs-4)通过水提醇沉、复溶、透析、浓缩、冷冻干燥得粗多糖,采用DEAE-纤维素离子交换、sephadex-G-100柱色谱分离纯化粗多糖,MTT法检测细胞增殖活性.结果:发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖经分离纯化得到均一成分,命名为CSMP-60-B-I.高效凝胶渗透色谱法测得其相对峰高分子量为32 336 Da.毛细管电泳测得单糖组成为木糖-阿拉伯糖-葡萄糖-半乳糖-甘露糖(0.09∶0.20∶1.00∶3.70∶3.58).高浓度ConA能抑制L-O2细胞增殖,而加入CSMP-60-B-I后,这种抑制作用大大减弱.结论:发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖的分离纯化产物CSMP-60-B-I对ConA抑制L-O2细胞增殖活性有拮抗作用,提示其可能有保肝作用.

目的:对深红虫草的次级谢产物进行分离、鉴定,为进一步发掘深红虫草活性物质和丰富虫草类真菌天然产物库提供参考.方法:采用正相硅胶柱层析、C18反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、薄层色谱等色谱技术对深红虫草发酵液中的化合物进行分离;通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱分析对分离的化合物进行结构鉴定.结果:从深红虫草发酵液的乙酸乙酯萃取部分共分离得到6个化合物,分别鉴定为5-甲基-1,3-苯二酚(化合物1)、4-hydroxy-17R-methylincisterol(化合物2)、5α,8α-氧桥-(22E,24R)-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(化合物3)、3β,5α,6b-三羟基-(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯(化合物4)、尿嘧啶核苷(化合物5)、卵孢菌素(化合物6).结论:本研究从该属真菌中分离得到了6个化合物,其中化合物1和化合物2为首次分离得到.

目的 分析不同发酵虫草菌粉类产品氨基酸的含量差异,结合聚类分析和主成分分析法评价发酵虫草菌粉类产品的质量.方法 采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量,色谱柱为LCA K06/Na离子柱,流动相为柠檬酸钠0.06 mol/L(pH 3.45) (A)-柠檬酸钠0.1 mol/L (pH 10.85) (B),梯度洗脱:0～3.5 min,100％ A;3.5～11.0 min,85％A;11.0～17.0 min,80％A;17.0～23.5 min,67％A;23.5～28.0 min,20％A;28.0～45.0 min,100％B,体积流量为0.45 mL/min洗脱泵+0.25 mL/min衍生泵;检测波长440 nm(脯氨酸)+570 nm(其余氨基酸);温度为58～74℃梯度控温,进样50 μL,外标法测定氨基酸含量.结果 分别对3种发酵虫草菌粉类产品A、B、C中氨基酸进行含量测定,产品A总氨基酸质量分数为251.82～265.93 mg/g,产品B总氨基酸质量分数为279.67～333.40 mg/g,产品C总氨基酸质量分数为321.37～370.86mg/g,样品各批次间一致性较好.产品A和产品B为同一原料药,氨基酸含量差异不明显,产品C中组氨酸和精氨酸含量与产品A和产品B存在较大差异.主成分分析筛选的前3个主成分的累积方差贡献率达到93.551％,包含了各样品中氨基酸含量的大部分信息.聚类分析将30批样品聚为2类,其中产品A和产品B聚为一类,产品C聚为一类,聚类分析结果与实际情况相符.变量聚类分析表明当氨基酸变量聚为5类时,随机选择其中的5个变量能够准确反映发酵虫草菌粉氨基酸的质量.结论 通过氨基酸含量差异研究,能够有效区别不同发酵虫草菌粉类产品,结合主成分分析和聚类分析能够客观评价发酵虫草菌粉类产品的质量.