虫草菌粉是从新鲜冬虫夏草中分离得到菌丝体经发酵培养而得,近年来因其显著的药理活性而受到广泛关注.虫草菌粉中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉2种菌丝体的化学成分和药理活性具有明显差异,通过对二者的研究进展进行较为全面客观的文献整理分析,以期为虫草菌粉的进一步研究和开发利用提供参考.

目的:比较不同种类及产地虫草多糖的单糖组成与比例.方法:采用纤维素薄层板,以乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水(7.0∶3.0∶0.2∶1.4)为展开剂分离多糖水解后的单糖组分,苯胺-邻苯二甲酸显色后采用薄层扫描仪于410 nm波长下扫描定量.结果:6个单糖(半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖和鼠李糖)线性关系良好(r＞0.995 7),检测限、定量限分别为0.02～0.10 μg和0.08～0.40 μg,方法具有良好的精密度、重复性和稳定性,RSD分别为3.1％～8.4％、2.3％～6.3％和0.66％～2.4％;平均回收率在94.0％和103.8％之间.不同种类虫草多糖均主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成,其中多数天然虫草及人工培养蛹虫草子实体样品中葡萄糖含量相对较高,葡萄糖与半乳糖含量的平均比值分别为5.2∶1和1.9∶1,葡萄糖与甘露糖含量的平均比值分别为16.9∶1和5.9∶1;不同人工发酵虫草菌粉样品中葡萄糖与半乳糖含量的平均比值为0.96∶1,葡萄糖与甘露糖含量的平均比值为2.0∶1;而古尼虫草、凉山虫草、亚香棒虫草、细虫草及蝉花样品中葡萄糖平均含量较低,葡萄糖与半乳糖含量的平均比值为0.31∶1,葡萄糖与甘露糖含量的平均比值为0.81∶1.结论:不同种类虫草多糖其单糖比例存在一定差异,此特征有利于对不同种类虫草质量的控制.

目的:建立一种快速分析发酵虫草菌丝粉中挥发性成分的方法,并用于不同菌种发酵虫草产品的鉴别和特征性成分的寻找.方法:利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME/GC-MS)技术测定发酵虫草菌丝粉的挥发性成分,在优化萃取头、萃取温度、吸附时间、预平衡时间和解吸时间等萃取条件的基础上,建立发酵虫草菌丝粉的HS-SPME/GC-MS测定方法,用峰面积归一化法计算各成分的相对含量,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)2种化学计量学方法对数据进行分析.结果:最佳萃取条件为DVB/CAR-PDMS萃取头、萃取温度90℃、吸附时间80 min、预平衡时间40 min、解析时间2min.利用建立的HS-SPME/GC-MS方法从金水宝胶囊、百令胶囊、宁心宝胶囊、至灵胶囊和心肝宝胶囊5种发酵虫草制剂中分别鉴定出56、71、72、81和75个化合物,主要包括酯类、醇类、羧酸类、醛类、烃类、酮类、杂环类化合物等.通过化学计量学方法对HS-SPME/GC-MS数据进行处理,实现了不同发酵虫草制剂和伪品的鉴别,并寻找到5种发酵虫草产品中的特征挥发性成分,分别为马索亚内酯、吡嗪酰胺、2-吡咯烷酮、棕榈酸乙酯和棕榈酸.结论:HS-SPME/GC-MS方法可用于发酵虫草产品中挥发性成分的快速分析.结合化学计量学方法对不同发酵虫草制剂进行鉴别和差异性成分寻找,为特征性指标成分的确定提供了一条新思路,为发酵虫草制剂质量标准的制定和提升提供了科学依据.

目前市场上已获得药品批准文号的发酵虫草菌类产品包括5种发酵虫草菌粉原料药及其相关制剂.由于原料药的起始菌株均为从天然冬虫夏草中分离而来,它们的名称和化学成分类似,临床作用也较为相近.但因其菌种和发酵工艺不同,质量具有明显的差异性,临床应用也各有侧重,故在使用中应予以明确区分.该类产品的研究开发多在20世纪80-90年代,不同产品的质量标准差异较大,部分产品质量控制水平较低.且目前发酵虫草菌类产品存在同时按化学药批准文号和中药批准文号管理的情况,其名称使用、监管和临床应用也较为混乱.该文通过对发酵虫草菌类产品的批准文号类别、质量标准及应用情况进行比较和梳理,总结了该类产品的标准情况和存在问题,提出规范产品名称、统一文号管理类别、增加专属性质量控制内容等相关建议,以期对发酵虫草菌粉及相关制剂的标准执行、质量控制以及药品监管提供参考.

目的:将发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖进行分离纯化,并观察纯化产物对ConA抑制人正常肝细胞(L-O2细胞株)增殖活性的拮抗作用.方法:发酵虫草菌粉(Cs-4)通过水提醇沉、复溶、透析、浓缩、冷冻干燥得粗多糖,采用DEAE-纤维素离子交换、sephadex-G-100柱色谱分离纯化粗多糖,MTT法检测细胞增殖活性.结果:发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖经分离纯化得到均一成分,命名为CSMP-60-B-I.高效凝胶渗透色谱法测得其相对峰高分子量为32 336 Da.毛细管电泳测得单糖组成为木糖-阿拉伯糖-葡萄糖-半乳糖-甘露糖(0.09∶0.20∶1.00∶3.70∶3.58).高浓度ConA能抑制L-O2细胞增殖,而加入CSMP-60-B-I后,这种抑制作用大大减弱.结论:发酵虫草菌粉(Cs-4)粗多糖的分离纯化产物CSMP-60-B-I对ConA抑制L-O2细胞增殖活性有拮抗作用,提示其可能有保肝作用.

目的 分析不同发酵虫草菌粉类产品氨基酸的含量差异,结合聚类分析和主成分分析法评价发酵虫草菌粉类产品的质量.方法 采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量,色谱柱为LCA K06/Na离子柱,流动相为柠檬酸钠0.06 mol/L(pH 3.45) (A)-柠檬酸钠0.1 mol/L (pH 10.85) (B),梯度洗脱:0～3.5 min,100％ A;3.5～11.0 min,85％A;11.0～17.0 min,80％A;17.0～23.5 min,67％A;23.5～28.0 min,20％A;28.0～45.0 min,100％B,体积流量为0.45 mL/min洗脱泵+0.25 mL/min衍生泵;检测波长440 nm(脯氨酸)+570 nm(其余氨基酸);温度为58～74℃梯度控温,进样50 μL,外标法测定氨基酸含量.结果 分别对3种发酵虫草菌粉类产品A、B、C中氨基酸进行含量测定,产品A总氨基酸质量分数为251.82～265.93 mg/g,产品B总氨基酸质量分数为279.67～333.40 mg/g,产品C总氨基酸质量分数为321.37～370.86mg/g,样品各批次间一致性较好.产品A和产品B为同一原料药,氨基酸含量差异不明显,产品C中组氨酸和精氨酸含量与产品A和产品B存在较大差异.主成分分析筛选的前3个主成分的累积方差贡献率达到93.551％,包含了各样品中氨基酸含量的大部分信息.聚类分析将30批样品聚为2类,其中产品A和产品B聚为一类,产品C聚为一类,聚类分析结果与实际情况相符.变量聚类分析表明当氨基酸变量聚为5类时,随机选择其中的5个变量能够准确反映发酵虫草菌粉氨基酸的质量.结论 通过氨基酸含量差异研究,能够有效区别不同发酵虫草菌粉类产品,结合主成分分析和聚类分析能够客观评价发酵虫草菌粉类产品的质量.

目的:对生精胶囊进行二次开发,对处方中冬虫夏草进行替代物筛选研究,并对替代后的新生精胶囊进行抗生精障碍药理研究,为其临床用于治疗男性不育症及性功能障碍症提供实验依据. 方法:取雄性昆明种小鼠192只,随机均分为对照组,模型组,发酵虫草菌粉高、中、低剂量(1.60、0.80、0.40 g/kg)组,虫草头孢菌粉高、中、低剂量(1.60、0.80、0.40 g/kg)组,虫草被孢菌粉高、中、低剂量(1.60、0.80、0.40 g/kg)组,发酵冬虫夏草菌粉高、中、低剂量(1.60、0.80、0.40g/kg)组,生精胶囊组(0.80 g/kg),维生素E组(0.25g/kg),除对照组外,其他各组小鼠腹腔注射环磷酰胺注射液60 mg/kg,每天1次,连续5d建立环磷酰胺致生精障碍小鼠模型,观察各组小鼠体重、性腺脏器系数、精子数、精子活力、精子畸形率.取健康雄性SD大鼠70只,随机分为对照组,模型组,新生精胶囊高、中、低剂量组,生精胶囊组(0.56g/kg),维生素E组(0.18g/kg),每组10只大鼠,除对照组外,其余各组动物灌胃腺嘌呤200 mg/kg,每日1次,连续5周制备生精障碍大鼠模型,观察各组大鼠体重,性腺器官及肾脏脏器系数、血清生殖激素、睾丸形态结构、生育力. 结果:各给药组可不同程度的改善环磷酰胺所致小鼠体重增长缓慢现象,在提高小鼠睾丸和附睾脏器系数,增加精子数、提高精子活率、增强精子活力、减少精子畸形率方面具有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01),综合观测以维生素E(0.25 g/kg)、生精胶囊(0.80 g/kg)和虫草头孢菌粉组(1.60、0.80、0.40g/kg)作用较为显著,拟定虫草头孢菌粉作为原方最优替代,按原生产工艺制备成新生精胶囊;新生精胶囊(1.60、0.80、0.40g/kg)可增加腺嘌呤模型大鼠的体重、性腺器官及肾脏脏器系数,增加血清FSH、LH、T、E2的含量(P＜0.05或P＜0.01),产生抗氧化损伤作用并改善睾丸病理形态损伤,促使雌性大鼠受孕率及平均产仔数上升,发挥抗腺嘌呤致大鼠生精功能障碍作用. 结论:以虫草头孢菌粉替代后制成的新生精胶囊对雄性大鼠具有促生育、改善生育及逆转受损生殖能力的作用,为验证虫草头孢菌粉作为冬虫夏草替代品的正确性与可行性提供一定指导意义,也为其临床用于男性不育及性功能障碍提供了实验依据.

结合形态学与ITS序列分析对7株野生虫草真菌进行分类鉴定.MTT法分析它们的菌丝体醇提取物对肝癌HepG2细胞增殖的抑制活性.鉴定结果表明菌株MF7、MF9、MF14为细脚棒束孢Isaria tenuipes,菌株MF11、MF12、MF13为蝉棒束孢Isaria cicadae,菌株MF10为球孢白僵菌Beauveria bassiana;MTT结果显示分离到的3株细脚棒束孢和3株蝉棒束孢的菌丝体醇提取物对HepG2的抑制活性较差,IC50均大于500μg/mL;球孢白僵菌MF10对HepG2细胞有一定抑制作用,IC50值为221.6μg/mL,略强于蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝粉产品金水宝胶囊(IC50=364μg/mL)和中华被毛孢发酵菌丝粉产品百令胶囊(IC50=268.7μg/mL).另外,发现供对比试验的3株蛹虫草菌株(MF1、MF5、MF15)对HepG2细胞均有较好的抑制作用,其中MF15的发酵菌丝体醇提取物活性最强,IC50为55.56μg/mL,暗示蛹虫草发酵菌丝体具有重要的研究价值.

目的:探究发酵虫草菌粉多糖的免疫活性.方法:发酵虫草菌粉通过水提醇沉、复溶、透析、浓缩、冷冻干燥得多糖,命名为CSMP-60,其提取条件:60℃水提、提取时间4 h、料液比1∶15、提取次数2次.以小鼠免疫细胞为材料,检测CSMP-60的免疫活性.结果:CSMP-60能促进脾细胞的增殖(P＜0.05),明显促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α(P＜0.05),有促进脾淋巴细胞分泌IFN-γ的趋势.结论:CSMP-60可能是发酵虫草菌粉产生免疫活性的效应物质之一.

目的:探讨发酵虫草菌粉(fermented cordyceps sinensis powder,CS)对二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝损伤的保护作用及对TGF-β1/Smads通路的影响.方法:无特定病原体(SPF级)健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,体质量(180±20)g,随机分为4组:对照组、模型组、CS治疗组与CS溶媒组,每组12只.模型组:灌胃给予10 mg/kg DEN每周5次共8周,构建慢性肝损伤模型;对照组:灌胃给予与模型组相同体积的生理盐水;CS治疗组:在建模4周后灌胃给予80 mg/kg CS每周5次共8周;CS溶媒组:灌胃给予与CS组相同体积的5％甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液.实验结束后,麻醉,脊椎脱臼法处死大鼠,收集血液,紫外分光光度法检测各组大鼠血清中AST、ALT以反映肝功能;H&E染色观察肝组织形态变化,Masson染色观察胶原沉积情况;改良Nycodenz法分离各组大鼠原代肝星状细胞(HSC),RT-qPCR检测肝组织与HSC中 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子(TGF)-β1、Smad3、Smad7 mRNA的表达水平;Western blot检测肝组织Smad3与Smad7蛋白表达水平.结果:与对照组相比,模型组大鼠血清中AST、ALT含量显著升高,H&E染色结果显示肝脏组织形态显著改变,Masson染色结果显示胶原沉积增多;与模型组相比,CS治疗四周能显著降低肝损伤大鼠血清中升高的AST、ALT水平,改善其肝脏病理损伤程度,减少肝脏中胶原沉积.RT-qPCR结果显示,CS可减少肝损伤大鼠组织及HSC中α-SMA、TGF-β1 mRNA表达水平,增加Smad7 mRNA表达水平;CS溶媒组各项检测指标均与模型组无差异;此外,Western blot结果显示,CS可下调肝损伤大鼠肝组织Smad3蛋白的表达,上调Smad7.结论:CS可显著改善DEN诱导的大鼠肝损伤,该作用可能与CS上调Smad7,并抑制TGF-β1/Smads通路有关.