[目的]明确小菜蛾Plutella xylostella成虫的飞行能力及飞行过程中的能源利用模式.[方法]利用飞行磨吊飞测定小菜蛾不同日龄未交配雌雄成虫的飞行能力;田间种群在室内继代饲养3代(F3)和20代(F20)后比较各种群飞行能力的差异;用酶联免疫试剂盒测定1日 龄未交配成虫吊飞0,2,6,12和24 h后胸部和腹部中甘油三酯和可溶性糖含量以及3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、海藻糖酶(trehalase,TRE)、3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase,GPD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、3-羟酰辅酶 A 脱氢酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,HOAD)和柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)6 种能量代谢关键酶活性的变化.[结果]根据吊飞的累计飞行时间(accumulative flight duration,AFD)可将小菜蛾种群划分为短飞型(AFD≤4.5 h)、中间型(4.5 h＜AFD≤8.5 h)和长飞型(AFD＞8.5 h)3种类型.小菜蛾不同日龄未交配雌成虫以及相同日龄雌雄成虫之间的吊飞能力没有显著差异;未交配1日龄雄成虫的累计飞行时间显著低于3-6日龄雄成虫的.F3和F20代种群的平均飞行速度和累计飞行距离显著低于田间种群的;F20代种群的累计飞行时间和长飞型个体比例较田间种群显著下降.吊飞24h内,1日龄未交配雌、雄成虫胸部和腹部中甘油三酯含量呈逐渐升高趋势;胸部中可溶性糖含量在静息状态下显著低于飞行状态,腹部中可溶性糖含量先降低后升高并于吊飞6 h时出现最低值.吊飞过程中6种能量代谢关键酶活性均随吊飞时间呈现逐渐升高的变化趋势,其中GAPDH,GPD和HOAD活性一直处于较高的水平,LDH和CS活性处于相对较低的水平;GAPDH:HOAD活性比略高于1.0,且在吊飞2 h时出现最大值.[结论]小菜蛾成虫有较强的飞行能力;飞行过程中其能源利用类型为混合型,但在飞行初始阶段(前2 h)利用糖类的能力比利用脂类的能力强;飞行中雌雄成虫均可以进行高速有氧代谢,也具备一定的无氧代谢能力.

[目的]本研究旨在解析ATP合酶亚基α(ATP synthase subunit α,ATPs-α)在棉铃虫Helicoverpa armigera变态和发育中的功能机理.[方法]PCR扩增棉铃虫ATPs-α基因开放阅读框,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR检测HaATPs-α在棉铃虫5龄蜕皮期和6龄第1-5天幼虫表皮、中肠和脂肪体中及外源20-羟蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)(0.1 mg/mL)处理后6龄幼虫表皮和脂肪体中的表达量;对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-α,分析RNAi降低HaATPs-α的表达量对幼虫发育及变态及其体内ATP含量、海藻糖和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性的影响.[结果]棉铃虫HaATPs-α的开放阅读框长1 677 bp,棉铃虫、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、斜纹夜蛾S.litura和粉纹夜蛾Trichoplusiani这4种鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆虫的ATPs-α氨基酸序列一致性为96.56％,且亲缘关系较近.表达模式分析结果显示,HaATPs-α在6龄第3天幼虫表皮和中肠中表达量最高,在5龄蜕皮期脂肪体中出现表达高峰;20E(0.1 mg/mL)处理较对照显著上调6龄幼虫中HaATPs-α的表达量.与对照组(注射dsGFP)相比,利用RNNAi敲低HaATPs-α表达量后,幼虫发育迟缓,幼虫体重显著下降,幼虫死亡率显著升高,化蛹率和成虫羽化率显著降低,ATP含量和海藻糖酶活性均显著降低,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量显著降低.[结论]HaATPs-α不仅控制棉铃虫ATP的产量,同时还影响着海藻糖和葡萄糖的含量,因此,HaATPs-α在幼虫变态中发挥着重要作用.本研究结果还可为将来利用ATPs-α作为有害生物防控的新靶标提供实验证据和理论依据.

[目的]海藻糖酶(trehalase,Tre) 作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用.本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica 海藻糖酶基因,并对其表达模式进行定量分析,以期探究海藻糖酶在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中的作用.[方法]根据沙葱萤叶甲转录组数据,采用RACE 技术,克隆得到Tre 基因的cDNA 全长,并进行生物信息学分析; 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 技术检测其在沙葱萤叶甲不同发育阶段[卵、 1 - 3龄幼虫、预蛹、蛹、成虫(羽化后3,7,10,15,25,40,60,80 和100 d) ]、成虫不同组织(头、胸和腹) 以及3 日龄成虫在不同温度(15,20,25,30,35 和40℃) 胁迫下的表达水平; 采用3,5-二硝基水杨酸法测定不同日龄成虫体内海藻糖酶活性.[结果]克隆获得了沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶基因,并命名为GdTre1(GenBank 登录号: KY697913),该基因全长1 933 bp,开放阅读框1 704 bp,编码567 个氨基酸; 蛋白预测分子量为66. 56 kD,等电点为6. 62; 编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1 条信号肽,不具有跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdTre1 与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b 的同源性最高,氨基酸序列一致性达 70. 25％.RT-qPCR 检测结果表明,GdTre1 在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达; 在成虫不同组织中,通常在腹部中表达量最高,其次为胸部,最低为头部; GdTre1 表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降.沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内GdTre1 表达量及Tre 活性存在显著差异,且GdTre1表达量与Tre 活性变化趋势一致.[结论]海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切的关系.该结果为进一步揭示该虫的夏滞育分子机理提供了必要的基础.

在昆虫中已发现成熟的典型胰岛素信号通路,但是其调控海藻糖代谢途径的机制还未清晰.为探讨胰岛素受体基因在褐飞虱海藻糖代谢平衡及其发育的调控作用,本文采用RNAi技术抑制胰岛素受体(InR)基因的表达,测定处理后海藻糖、糖原和葡萄糖含量及海藻糖酶活变化,并检测InR、类胰岛素多肽(Ilp)、海藻糖代谢途径中关键基因的表达.研究结果表明dsRNA注射后能够显著抑制Ilp和InR基因的表达;InR1低表达后72 h能够显著抑制3种糖类物质的含量;InR表达抑制后72 h可溶性海藻糖酶活性上升,而膜结合型海藻糖酶活性下降;当InR表达受抑制后3个海藻糖酶和2个海藻糖合成酶基因的表达都显著下降.这些结果说明InR能够影响海藻糖等糖类物质的平衡.从而为将来通过调控昆虫血糖平衡来控制害虫提供理论依据.

[目的]异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用.本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考.[方法]根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中.采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化.[结果]结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型.可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射ds TRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+ dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降.注射dsTRE2-like,dsTRE2和dsTRE2-like+ dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶(glycogen synthase,GS)基因的表达均显著下调.[结论]TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响.研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础.

分析赤拟谷盗海藻糖酶基因(Trehalase,简称TRE)家族的特性及RNAi介导的TRE基因沉默后的相互作用效果.采用生物信息学和相关软件分析5个海藻糖酶基因序列特征以及二级结构等分子特性并推测其生理功能,用MEGA 6.0软件构建TRE与其它昆虫TRE的系统进化树;采用注射RNAi技术,分别干扰赤拟谷盗海藻糖酶基因mRNA的表达;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测单个海藻糖酶基因表达抑制后对其它TRE基因mRNA表达的影响.赤拟谷盗4个可溶性海藻糖酶TRE1蛋白相似性高,具有类似的二级结构,即含有相似比例的α-螺旋、 β-折叠和无规则卷曲,膜结合型海藻糖酶TRE2与TRE1在蛋白质的二级结构上差异较大;系统进化树分析表明赤拟谷盗的可溶性海藻糖酶与其它昆虫的TRE1聚集在一起,膜结合型海藻糖酶与其它昆虫的TRE2聚集在一起;RNAi实验结果表明单独干扰某个TRE1基因的mRNA表达后,其它3个TRE1基因的表达有的上升,有的下降,而TRE2基因表达都为显著下降;单独干扰TRE2基因表达,则其它4个TRE1基因的表达一致显著下降.赤拟谷盗可溶性TRE1和膜结合型TRE2的二级结构差异较大,单个TRE基因表达被抑制后,其他TRE基因存在连锁抑制或者互补功能.

[目的]深入了解镉对白纹伊蚊Aedes albopictus的毒害作用机理和白纹伊蚊对极端环境的适应机制,揭示重金属胁迫对白纹伊蚊种群发生、疾病传播等可能存在的影响,为卫生害虫防控等提供参考依据.[方法]分别用200 mL配制好的50,100,200,300和400 mg/L镉溶液对放置于320 mL一次性杯中长势一致的白纹伊蚊3龄末至4龄初幼虫急性染毒12 h,以双蒸水养殖幼虫作为对照.通过生化方法测定处理后12 h白纹伊蚊幼虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及可溶性海藻糖酶(TRE1)和膜结合型海藻糖酶(TRE2)活力,并采用qRT-PCR测定这些幼虫体内海藻糖合成酶基因(TPS),TRE1和TRE2表达量.[结果]在200和300 mg/L重金属镉处理12 h时白纹伊蚊幼虫海藻糖含量显著增加,在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时葡萄糖含量显著下降,而不同镉浓度急性处理对总糖原含量没有影响.TRE1和TRE2活力在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时显著下降.300 mg/L镉处理组TPS相对表达量达到最高值,TRE1和TRE2相对表达量在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时显著下降,与酶活力变化趋势表现一致.[结论]当镉浓度低于半致死浓度(217 mg/L)时,镉急性胁迫使白纹伊蚊幼虫TPS基因表达上调,而TRE基因则表达量下降,TRE活力降低,从而促使葡萄糖转化为海藻糖,通过海藻糖的积累来应对镉胁迫压力.这些结果说明海藻糖在白纹伊蚊在重金属应激中起一定作用,白纹伊蚊幼虫可以通过合成海藻糖从而提高应对镉胁迫的抗逆能力.

[目的]昆虫中海藻糖主要通过海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)在脂肪体中合成,当昆虫受极端环境胁迫时TPS能够诱导海藻糖累积从而起到保护作用.本研究旨在分析白背飞虱Sogatella furcifera两个TPS基因的发育和组织表达模式及其对糖类物质代谢调控功能,探究TPS基因在白背飞虱生长发育中的具体作用.[方法]基于实验室前期获得的两个海藻糖合成酶基因SfTPS1和SfTPS2片段序列,在本实验中也进行了基因克隆和测序筛选,比对两者确定了白背飞虱两个TPS基因序列.并通过MEGA 7.0软件构建基于氨基酸序列的白背飞虱与其他昆虫TPS的系统发育树.利用qRT-PCR技术检测这两个基因在白背飞虱不同发育阶段(4龄第1天若虫至3日龄成虫)和成虫不同组织(头、足、翅、中肠、脂肪体、表皮和马氏管)中的表达情况.合成这两个基因的dsRNA,并注射到白背飞虱5龄第1天若虫中进行RNAi.在RNAi 48和72 h后检测白背飞虱海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2和TRE2的表达变化,海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及海藻糖酶活性.[结果]克隆获得白背飞虱SfTPS1和SfTPS2,ORF分别为2 424和2 115 bp,编码氨基酸数目分别为807个和704个,预测蛋白质分子量分别为90.37和80.56 kD,等电点分别为6.08和6.10.而且白背飞虱2个TPS氨基酸序列与褐飞虱Nilaparvata lugens TPS1和TPS2的一致性最高.发育阶段表达模式表明,白背飞虱TPS基因SfTPS1和SfTPS2在4龄若虫到成虫阶段都有表达;组织表达模式表明,SfTPS1和SfTPS2在成虫马氏管、中肠和表皮中的表达较为显著.当SfTPS1被RNAi后,TRE1-1和TRE2的表达水平与对照组(dsGFP注射组)相比分别为略有上升和显著升高,TRE 1-2的相对表达水平在SfTPS1被RNAi 48 h后显著上升而在72 h后显著下降;可溶性海藻糖酶活性无显著变化,膜结合型海藻糖酶活性显著增加;白背飞虱5龄若虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升.TRE1-2和TRE2基因的表达水平在SPS2被RNAi 48 h后显著升高,而在72 h后两基因的表达水平却显著下降;TRE1-1基因的表达水平在注射dsSfTPS2 48和72 h后均显著上升.可溶性海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 48 h后显著下降,72 h后显著上升;膜结合型海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 72 h后显著增加.白背飞虱5龄若虫体内葡萄糖含量在SfTPS2基因RNAi 48 h后显著减少,但在72 h后海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升.[结论]通过调节白背飞虱体内TPS基因的表达影响TRE1-1,TRE 1-2及TRE2基因的表达水平,进而调控体内海藻糖的含量,该结果为后期采用TPS为靶标基因用于害虫防治提供理论依据.

[目的]类胰岛素多肽(insulin-like peptide,Ilp)位于胰岛素信号通路最上游,其在糖类物质调控中发挥关键作用.本研究则旨在探究Ilp在褐飞虱Nilaparvata lugens海藻糖代谢平衡的调控作用.[方法]以褐飞虱5龄若虫为实验材料,采用RNAi技术干扰Ilps的表达,观察RNAi后褐飞虱的表型以及雌成虫的卵巢发育.RNAi 48 h与72 h后,采用生化方法测定褐飞虱5龄若虫体内海藻糖、糖原和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性变化;采用qPCR检测海藻糖酶基因(TRE1-1,TRE1-2和TRE2)和海藻糖合成酶基因(TPS1和TPS2)的表达量变化.[结果]dsRNA可有效抑制Ilps的表达,导致褐飞虱出现异常翅型,且注射dsIlp3以及dsIlp1+dsIlp2+ dsIlp3+dsIlp4发现褐飞虱2日龄雌成虫卵巢发育不完全.分别注射dsIlp1-4和dsIlp1+dsIlp2+ dsIlp3+dsIlp4后48 h均能显著提高葡萄糖含量;分别注射dsIlp2,dsIlp3及dsIlp4后48 h显著提高了糖原含量;分别注射dsIlp3和dsIlp4后48 h能够显著提高海藻糖含量,而分别抑制Ilp2和Ilp472 h后海藻糖含量显著下降,但注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48和72 h海藻糖含量都显著上升.注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h可溶性海藻糖酶活性均显著上升,膜结合型海藻糖酶活性则在分别注射dsIlp3,dsIlp4和dsIlp1+dsIlp2+ dsIlp3+dsIlp4后72 h显著下降;分别注射dsIlp1,dsIlp2和dsIlp4后TRE1-1,TRE1-2,TRE2,TPS1和TPS2的表达量显著下降.[结论]沉默Ilp基因对褐飞虱的发育以及繁殖有一定的阻碍作用,且能够提高褐飞虱体内葡萄糖与糖原的含量,下调海藻糖酶与海藻糖合成酶基因表达量,提高可溶性海藻糖酶的活性,进而调控海藻糖的代谢.

[目的]本研究旨在解析ATP合酶亚基d(ATP synthase subunit d,ATPs-d)参与海藻糖代谢调控棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫发育和变态中的功能及分子机理.[方法]PCR扩增棉铃虫HaATPs-d的开放阅读框,并利用生物信息学方法对其序列及系统发育进行分析;利用qRT-PCR检测HaATPs-d在5龄蜕皮期幼虫和6龄幼虫表皮、中肠和脂肪体中及对20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)(0.1 mg/mL)响应的6龄幼虫脂肪体和表皮中的表达量;利用荧光拍照分析HaATPs-d在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞中的亚细胞定位;采用酵母双杂交分析与HaATPs-d互作的蛋白;对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-d,分析RNAi降低HaATPs-d的表达量对幼虫发育及变态和中肠中可溶性海藻糖酶活性和海藻糖含量的影响.[结果]棉铃虫HaATPs-d(GenBank登录号:LOC110375576)的开放阅读框长525 bp,编码174个氨基酸并具有较高的保守性,与草地贪夜蛾和斜纹夜蛾S.litura中的ATPs-d亲缘关系较近.HaATPs-d的表达高峰出现在6龄第3天幼虫表皮中,在中肠和肪体中的表达量均以在5龄蜕皮期幼虫中的最高.与对照相比,20E(0.1 mg/mL)显著上调6龄幼虫脂肪体和表皮中HaATPs-d的表达量.HaATPs-d是细胞质蛋白.与注射dsGFP对照组比较,HaATPs-d与棉铃虫可溶性海藻糖酶直接结合.棉铃虫6龄幼虫中敲低HaATPs-d的表达量导致幼虫发育迟缓,幼虫体重下降,幼虫死亡率升高,化蛹率和成虫羽化率降低,中肠中可溶性海藻糖酶活性显著下降和海藻糖含量显著上升.[结论]HaATPs-d通过与棉铃虫可溶性海藻糖酶的直接结合控制幼虫体内可溶性海藻糖酶性和海藻糖含量,进而影响幼虫变态中的糖源,最终控制幼虫的变态.