蒙古冰草(即沙芦草(Agropyron mongolicum))是我国北方代表性的多年生牧草之一,具有较强的耐寒和耐旱能力.在植物中,咖啡酸氧甲基转移酶基因(COMT)是参与木质素和褪黑素生物合成的关键基因,在调节植物生长、品质和抗逆性中发挥重要作用.通过分析蒙古冰草全长转录组数据,从蒙古冰草中克隆了COMT候选基因AmCOMT1.该基因在茎秆和根等木质素含量高的组织中高表达,且其表达受多种非生物胁迫诱导.在拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型(Col-0)和突变体(omt1-2)中过表达AmCOMT1,显著促进了转基因拟南芥的木质素合成,使突变体的木质素单体和组分恢复至野生型水平,同时Col-0135S:AmCOMT1中木质素总量提高11％.此外,AmCOMT1过表达显著提高了Col-0/35S:AmCOMT1转基因拟南芥的褪黑素含量.在盐胁迫条件下,该株系平均根长相比野生型拟南芥提高20.3％,表现出更强的抗逆性.综上,蒙古冰草AmCOMT1基因在木质素和褪黑素合成中发挥关键作用,可提高转基因拟南芥的抗逆性,在蒙古冰草等单子叶牧草遗传改良方面具有重要应用潜力.

为研究干旱胁迫及复水对马铃薯(Solanum tuberosum)类黄酮合成途径影响的机制,以'克新1号'为试验材料,利用高通量测序技术分析了苗期干旱处理(40%土壤相对含水量维持14 d,DT)与对照(70%土壤相对含水量维持14 d,DCK)、复水处理(40%土壤相对含水量持续14 d,然后恢复到70%土壤相对含水量维持7 d,RT)与对照(70%土壤相对含水量维持21 d,RCK)之间类黄酮合成途径中基因表达的差异.结果表明,干旱胁迫后,马铃薯中类黄酮合成途径变化显著(P<0.01),该途径共有10个基因发生了差异表达,影响7个酶的合成,其中查尔酮合酶(EC 2.3.1.74)、柚皮素3-双加氧酶(EC 1.14.11.9)、类黄酮3′,5′-羟化酶(EC 1.14.13.88)的基因表达显著上调,从而可能促进了异黄酮、黄酮醇和黄酮以及高圣草素、二氢杨梅素的形成.PGSC0003DMG400019110和PGSC0003DMG400003563的上调表达导致查尔酮合酶和柚皮素3-双加氧酶的合成加快.复水对类黄酮合成途径的恢复效果较好,差异表达基因减少到2个,除莽草酸邻羟基肉桂酰转移酶(EC 2.3.1.133)与咖啡酰CoA-O-甲基转移酶(EC 2.1.1.104)的基因表达仍存在显著差异外,其余酶均已无差异.

该研究根据板栗(Castanea mollissima Bl.)cDNA文库分析得到EST序列,采用RT-PCR技术,克隆板栗咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid O-methyhransferase,COMT)基因全长cDNA(CmCOMT),分析其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究,为板栗木质素合成关键酶基因Cm COMT的生物学功能研究与应用奠定基础.结果表明:(1) CmCOMT基因(GenBank登录号为KU365322)具有一个1 098 bp开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,推测蛋白分子质量为39.684 9 kD,理论等电点为5.83,具有植物SAM依赖甲基转移酶的典型特征.(2)CmCOMT核苷酸序列及其编码氨基酸序列与垂枝桦(Betula pendula)和白桦(Betula platyphylla)的相应序列一致性均在90％以上;同源建模表明,CmCOMT的3D模型与苜蓿(Medicago sativa)MsCOMT的蛋白结构相似,推测其可能与MsCOMT具有相似的功能;系统发育树分析显示,CmCOMT与其他植物COMTs具有相同的进化祖先,与桦木科植物物种亲缘关系最近.(3) SDS-PAGE电泳分析表明,CmCOMT蛋白最佳诱导表达条件为0.3 mmol/LIPTG在25℃下诱导6h,蛋白分子量约为44 kD,其主要以可溶性蛋白的形式存在.

目的:利用烟草遗传转化体系,研究尾叶桉(Eucalyptus urophylla)咖啡酸氧甲基转移酶基因(EuCOMT)和咖啡酰CoA氧甲基转移酶基因(EuCCoAOMT)对木质素单体合成的定向调控效果.方法:分别利用EuCOMT的正义片段、EuCCoAOMT的全长RNAi片段进行单基因和二价基因的烟草转化研究,并对转基因烟草植株中目标基因表达水平、木质素和纤维素的含量、茎部解剖结构及木质素单体含量进行检测.结果:分别获得了转基因植株C-S(转EuCOMT正义片段)、CR(转EuCCoAOMT全长RNAi片段)、C-CR(EuCOM和EuCCoAOMT二价基因转化).烟草中转入的正义EuCOMT的片段能够正常表达,而EuCCoAOMT的全长RNAi片段对烟草CCoAOMT基因引发了强烈的抑制.转基因烟草的生长形态、木质素、纤维含量及解剖结构与野生型无显著差异.转基因植株C-S中G木质素含量升高17.72％,S/G值降低17.99％;CR中S/G值升高61.62％,C-CR中G木质素降幅达到57.38％,S/G比值升幅达到114.94％.结论:抑制CCoA OMT对G木质素合成具有显著的抑制效果,EuCOMT和EuCCoAOMT二价基因转化对S/G比值的定向调控效果最为理想.

通过iTRAQ(同位素相对标记与绝对定量)定量蛋白质组学技术分析陆地棉矮化突变体陆矮l号(LA-1)及其近等基因系LH-1茎尖的差异表达蛋白,发现苯丙氨酸合成途径的关键调控元件色氨酸生物合成酶trpD在LA-1中表达下调,苯丙氨酸代谢途径关键酶4-香豆基辅酶A连接酶(4CL)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)、转肉桂酸单氧酶亚家族基因(CYP73A)在LA-1中表达上调.通过实时定量PCR检测发现trpD、4CL、CCoAOMT、CYP73A基因转录水平与蛋白表达的趋势一致.对两种材料不同节间(倒1至倒6)的石蜡切片进行观察发现,从倒1节间到倒6节间,LA-1维管层与皮层宽度的比值均极显著大于LH-1,在相同节间,LA-1的导管的数目明显多于LH-1,维管层的发育要早于LH-1.这些研究结果揭示了陆地棉矮化突变体LA-1的矮化与苯丙氨酸合成和代谢途径存在相关性,为进一步发掘调控陆地棉矮化的关键基因和深入了解相关分子机制提供理论依据.

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是合成褪黑素的关键酶,影响植物体内褪黑素的含量.本课题组前期研究表明,过表达SlCOMT1能够显著提高番茄植株中内源褪黑素的含量.但目前关于内源褪黑素缓解番茄干旱胁迫的文章尚未有报道.本试验以3个独立的过表达SlCOMT1 (OE1、OE2、OE3)番茄株系为材料,采用PEG模拟干旱试验,研究过表达SlCOMT1缓解番茄干旱胁迫的生理机制.试验结果表明,过表达SlCOMT1提高了内源褪黑素的含量,同时提高了干旱胁迫下番茄植株的光合作用和抗氧化能力,进而诱导了胁迫相关信号基因的表达,提高了番茄抗旱性;另外,过表达SlCOMT1通过调控脱落酸(ABA)合成促使气孔关闭,降低了干旱胁迫下的水分散失.本研究拟为利用内源褪黑素调控植物抗旱性提供一定的理论基础.

目的 克隆菘蓝Isatis indigotica中咖啡酸氧甲基转移酶(I.indigotica fortune caffeic acid O-methyltransferase,IiCOMT)编码基因,并进行生物信息学及表达分析.方法 采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆菘蓝IiCOMT的全长cDNA,进而通过PCR获得其基因组DNA序列.通过qRT-PCR检测IiCOMT在四倍体菘蓝和二倍体菘蓝各器官以及不同胁迫条件下的表达情况.结果 IiCOMT全长cDNA为1376 bp(GenBank登录号DQ115905),包含1个1092 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码363个氨基酸残基,其对应的DNA序列含有3个内含子,4个外显子.IiCOMT基因在2种倍性菘蓝的根茎叶均有表达,且四倍体菘蓝中的表达均高于二倍体.胁迫因素盐处理(NaCl)、冷处理(4℃)、水杨酸(salicylicacid,SA)、茉莉酸甲脂(methyl jasmonate,MeJA)、赤霉素(gibberellic acid,GA3)和脱落酸(abscisic acid,ABA)均能诱导IiCOMT表达水平上调.结论 IiCOMT的克隆及表达分析,为进一步阐明与咖啡酸氧甲基转移酶相关的四倍体菘蓝优良性状形成的分子机制奠定了基础.

单木质素醇(H型、G型和S型)是构成植物木质素和木脂素的基本单元,其组成的不同直接决定木质素和木脂素的化学多样性和生物活性差异.咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)可催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化,在不同类型单木质素醇的构成中起决定作用,是木质素和木脂素生物合成途径的关键酶.2010年的相关综述主要对COMT的基因特征和在木质素生物合成中的调控作用作了介绍,文中聚焦了近十多年来COMT的最新研究进展,从基因特征、表达特征、结构特征和调控作用几个方面进行全面综述,并对COMT的研究和应用前景进行展望.

O-甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT)是植物中调控次生代谢产物生物合成的一类关键酶,主要功能是催化酚类物质发生氧甲基化反应.本研究在白木香(Aquilaria sinensis)转录组中筛选到一个OMT编码基因AsOMT1,该基因与2-(2-苯乙基)色酮合成关键酶基因(PECPS)表达高度正相关.AsOMT1基因全长1456 bp,包含一个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸;氨基酸序列比对和系统进化聚类分析发现该AsOMT1属于咖啡酸O-甲基转移酶亚家族.AsOMT1基因启动子区存在多个激素和胁迫应答元件;实时荧光定量PCR结果显示,伤害处理和乙烯处理均能显著上调AsOMT1的表达,推测其可能参与了沉香2-(2-苯乙基)色酮的生物合成.

目的:探究具有保肝利胆作用的7种茵陈单体化合物(6,7-二甲氧基香豆素、对羟基苯乙酮、绿原酸、咖啡酸、茵陈色原酮、东莨菪内酯和茵陈黄酮)对黄疸大鼠血清培养的hiHep细胞中水通道蛋白8(AQP8)表达的影响.方法:将SD大鼠分为正常组和模型组,通过α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导构建黄疸大鼠模型.检测两组大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平.将人源诱导型肝样细胞(hiHep)随机分为9组:对照组、黄疸血清组(JS组)、黄疸血清+6,7-二甲氧基香豆素组(JS+DME组)、黄疸血清+对羟基苯乙酮组(JS+4-HYD组)、黄疸血清+绿原酸组(JS+CHA组)、黄疸血清+咖啡酸组(JS+CAA组)、黄疸血清+茵陈色原酮组(JS+CAP组)、黄疸血清+东莨菪内酯组(JS+SCO组)和黄疸血清+茵陈黄酮组(JS+ARC组).对照组细胞使用含10％正常大鼠血清的培养基培养,其他组细胞均使用含10％黄疸大鼠血清的培养基培养.对照组和JS组细胞不做药物处理,其他组细胞均分别使用20mg/L的相应药物培养48h.通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力.检测各组细胞的蛋白质渗透压反射系数σ.通过qRT-PCR检测细胞中AQP8的mRNA水平,通过Western blot检测细胞中AQP8、环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)的蛋白表达水平.结果:与正常组比较,模型组大鼠血清中ALP、ALT、AST和TBIL水平均显著升高(P＜0.05).各组细胞活力差异无统计学意义(F=1.085,P=0.391).与对照组比较,JS组细胞的 σ 值降低(P＜0.05),与 JS 组比较,JS+DME 组、JS+4-HYD 组、JS+CHA 组、JS+CAA 组、JS+CAP 组、JS+SCO 组和 JS+ARC组细胞的σ值均升高(P＜0.05).与对照组比较,JS组细胞AQP8的mRNA和蛋白相对表达量降低(P＜0.05),cAMP和PKA的蛋白相对表达量降低(P＜0.05).与JS组比较,JS+DME组、JS+4-HYD组、JS+CHA组和JS+CAP组细胞AQP8的mRNA和蛋白相对表达量升高(P＜0.05),cAMP和PKA的蛋白相对表达量升高(P＜0.05).JS组与JS+CAA组、JS+SCO组和JS+ARC组细胞AQP8的mRNA和蛋白相对表达量以及cAMP和PKA的蛋白相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:本研究表明6,7-二甲氧基香豆素、对羟基苯乙酮、绿原酸和茵陈色原酮可上调黄疸大鼠血清培养的hiHep细胞中AQP8的表达,这可能是茵陈治疗黄疸的机制之一.