目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:通过研究中国马源P[12]型轮状病毒GST-VP8*-HorseP[12]E403蛋白与寡糖、唾液受体的结合特征，进而为轮状病毒的跨种传播及受体间的作用机制提供重要科学依据。方法:通过大肠杆菌表达系统表达、纯化中国马源P[12]型轮状病毒GST-VP8*-Horse P[12]E403蛋白，并利用唾液及寡糖结合实验分析该基因型的受体结合特征。结果:马源GST-VP8*-Horse P[12]E403蛋白与黏蛋白核心mucin core 2糖结合良好，与A、B、Lewis型等寡糖及唾液中的HBGAs均不结合。结论:VP8*-Horse P[12]E403蛋白的潜在受体可能是黏蛋白核心2，未与人唾液发生结合。

目的:探究高压氧(HBO)处理对心肌炎模型大鼠心功能的保护作用及其作用机制。方法:4～5周龄的SPF级SD雄性大鼠30只，按照数字表法随机分成3组，每组10只，分别为对照组、模型组和HBO组。对照组仅给予1 ml/kg的生理盐水尾静脉注射，不作其他处理；模型组和HBO组采用大肠杆菌脂多糖(LPS)尾静脉注射法构建大鼠心肌炎模型；HBO组模型大鼠进行HBO处理。连续处理6 d后，采用小动物超声成像系统获得大鼠超声心动图，并采集大鼠左心室射血分数(EF)、短轴收缩率(FS)，最大上升下降速率(±dp/dt max)等数据。ELISA法检测血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、脑钠肽(BNP)和过氧化氢酶(CAT)含量。将大鼠安乐死后取心肌组织，一部分HE染色后用于心肌组织形态学观察，另一部分研磨后，ELISA法检测心肌组织中氧化应激相关因子超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的表达水平。 结果:超声心动图检测结果显示，模型组大鼠EF、FS、＋dp/dt max、-dp/dt max较对照组明显降低；HBO处理后，HBO组EF、FS、＋dp/dt max、-dp/dt max较模型组组明显升高，差异均有统计学意义( P<0.05)。模型组大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、BNP较对照组明显升高；HBO处理后，HBO组IL-6、IL-1β、TNF-α、BNP水平较模型组明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。光镜下，对照组大鼠心肌组织无炎性细胞局灶性浸润；模型组心肌细胞排列紊乱，具有较多的炎性细胞浸润，部分血管内可见渗出粉红色的蛋白黏液；HBO组心肌炎性细胞浸润，但较模型组轻，可见心肌细胞水肿。与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中SOD以及血清中CAT蛋白表达水平明显下调，而MDA表达水平明显上调，差异有统计学意义( P<0.05)。与模型组比较，HBO组大鼠心肌组织中SOD以及血清中CAT蛋白表达水平明显上调，而MDA表达水平明显下调，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:HBO处理可通过抑制心肌炎模型大鼠体内的炎性反应，缓解氧化应激损伤，从而改善大鼠心功能。

目的:研究A组P[15]型轮状病毒VP8*蛋白的多糖结合特异性。方法:利用大肠杆菌表达系统制备A组P[15]型牛轮状病毒毒株的VP8*蛋白，通过寡糖结合实验、生物膜层干涉实验及血凝等方法研究其与不同糖的结合。结果:A组P[15]型牛轮状病毒VP8*蛋白结合Neu5Ac和Neu5Gc唾液酸，与α2, 3和α2, 6方式连接的唾液酸糖也有较好的结合。此外，P[15] VP8*蛋白可以凝集人和动物的红细胞。结论:唾液酸可能是A组P[15]型轮状病毒的糖受体。与猴P[3]、猪P[7]轮状病毒相似，牛P[15]VP8*蛋白与唾液酸结合，并且序列和结构分析显示它们具有相同的糖结合位点。

目的:探讨肠道菌群紊乱对小鼠系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)发生发展的影响及机制。方法:40只雌性美国癌症研究所(Institute of Cancer Researc，ICR)小鼠随机分为正常对照组(normal control，NC)、菌群紊乱模型组(disorder flora model，DFM)、SLE模型对照组(SLE model control group，SM)和菌群紊乱SLE组(disorder flora SLE model，DS)，每组10只。实验结束后，进行小鼠器官指数检测；HE染色观察肾脏病理改变；粪便活菌选择性培养计数分析小鼠肠道菌群的变化；酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中抗核抗体和抗组蛋白抗体；实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测脾脏组织中白细胞介素(interleukin，IL)-2 mRNA的表达水平。结果:成功建立肠道菌群紊乱小鼠模型，与DS组相比，NC组、DFM组、SM组大肠杆菌、粪肠球菌数量明显降低，双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显升高，差异均具有统计学意义( F＝289.60、143.90、504.40、1687.00， P值均<0.05)；与DFM组/SM组相比，DS组大肠杆菌和粪肠球菌数量明显增加，双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显减少，差异均具有统计学意义[logCFU/g：(6.94±0.01)或(6.87±0.01)比(6.96±0.01)，(5.85±0.01)或(5.77±0.01)比(5.89±0.01)，(8.91±0.01)或(8.98±0.01)比(8.73±0.02)，(8.77±0.01)或(8.92±0.00)比(8.60±0.01)， P值均<0.05]。与DS组比较，NC组、DFM组、SM组小鼠体重显著升高，脾指数、肾指数和胸腺指数显著降低，差异均有统计学意义( F＝92.02、26.99、29.43、17.06， P值均<0.05)。与NC组相比，DFM组、SM组和DS组小鼠的抗核抗体、抗双链DNA抗体水平显著增加，差异具有统计学意义( F＝332.10、1151.00， P值均<0.05)；与DFM组相比，SM组和DS组小鼠的抗双链DNA均显著增加，差异有统计学意义[pg/mL：(1.86±0.23)比(6.49±0.56)或(8.58±0.42)；ng/ mL: (7.76±0.70)比(17.66±0.14)或(18.51±0.10)， P值均<0.05]。HE染色结果显示，与NC组和DFM组相比，SM和DS组小鼠肾脏可见肾小球内细胞数量明显增多，肾间质及血管周围可见炎性细胞浸润。与NC组比较，DFM组、SM组和DS组小鼠脾脏组织IL-2 mRNA表达均显著下降，差异有统计学意义[(2.05±0.14)比(1.69±0.20)比(1.52±0.11)比(1.01±0.13)， F＝16.83， P<0.05 ]。 结论:肠道菌群紊乱能够影响相关细胞因子表达，促进SLE的炎症反应，进而加重SLE的发生发展。

目的:构建人降钙素原（hPCT）原核表达载体，低成本、快速、高浓度、高纯度获取hPCT纯化蛋白，为临床实验室检测制备质控品和参考物质奠定基础。方法:将GenBank提供的hPCT编码序列经大肠杆菌密码子优化后，人工合成DNA片段克隆至pET-28a(+)原核表达载体以构建重组hPCT表达质粒。转化至大肠杆菌 E. coli BL21感受态中，优化诱导表达条件、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化。 结果:成功构建重组hPCT原核表达质粒，优化异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达浓度及诱导温度，最适IPTG浓度为0.2 mmol/L，最佳诱导温度为37 ℃。纯化后hPCT蛋白可通过临床检测，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系，回归方程为y=-0.0085x+112.63， R2值为0.9975。 结论:成功构建重组hPCT的高效表达系统，重组hPCT蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有成为候选室间质量评价参考物质的潜力。

目的:探索原核表达系统生产的T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白-1-Fc(Tim-1-Fc)融合蛋白能否为Tim-1蛋白模拟品。方法:大肠杆菌合成Tim-1-Fc融合蛋白，以体外蛋白质结合实验测定其能否与Tim-4蛋白结合。通过荧光激活的细胞分选(FACS)检测磷脂酰丝氨酸(PS)与膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)间的结合情况，间接探明该蛋白与PS的结合。结果:体外蛋白相互作用实验证实Tim-1-Fc融合蛋白可以结合Tim-4蛋白。FACS数据分析表明无论有无过氧化氢诱导，Tim-1-Fc组凋亡细胞FITC信号平均强度(231.16±8.27、263.45±7.91)均高于对照组(190.80±5.09、203.29±10.89， t＝－7.200、7.739， P<0.01)，差异有统计学意义。 结论:原核表达版本的Tim-1-Fc融合蛋白可能具备在体外模拟Tim-1蛋白的作用。

目的 对艾草Artemisia argyi β-石竹烯合成酶基因(β-caryophyllene synthase,AaCPS)进行全长克隆、亚细胞定位与表达模式分析,为艾草倍半萜生物合成途径中的基因功能解析奠定基础.方法 基于艾草转录组数据筛选注释为CPS的基因,采用PCR方法克隆获得目的基因cDNA的全长,对其编码区进行生物信息分析;构建原核表达载体,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;构建绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,利用农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法进行亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析不同采收期(4月、5月、6月、7月)AaCPS基因表达模式,HS-SPME-GC-MS测定β-石竹烯含量并进行相关性分析.结果 从艾草中克隆得到的AaCPS基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1647 bp,编码548个氨基酸,相对分子质量为63 667 Da,等电点为5.40,含Terpene_synth和Terpene_synth_C保守结构域.系统进化分析显示AaCPS蛋白与同科植物黄花蒿CPS蛋白的亲缘关系最近.SDS-PAGE结果证实在75 000-120 000 Da出现目的蛋白条带(包含28 132 Da的标签蛋白),说明所获基因能够成功表达出蛋白;亚细胞定位显示其编码蛋白位于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明AaCPS基因表达量呈上升趋势,在7月达到最高.HS-SPME-GC-MS结果显示β-石竹烯含量从4月逐渐升高,在6月达到最高,与4-6月AaCPS基因表达量趋势总体一致.结论 通过对AaCPS基因的克隆与分析,为进一步研究该基因在艾草倍半萜物质生物合成途径的功能鉴定奠定基础.

基因元件的标准化和模块化为日益复杂的遗传系统改造设计提供了参考.目的:通过探究5'-非翻译区(5'-untranslated region,5'-UTR)在大肠杆菌体内外对翻译起始调控的一致性,挖掘通用型5'-UTR序列为模块化工程增添具有良好特征的遗传元件.方法:构建包含25 nt的5'-UTR随机文库化转至大肠杆菌中,通过测量样品荧光值(Flu)和OD600来量化其体内的相对活性值;利用大肠杆菌BL21 Star(DE3)细胞抽提物进行体外蛋白质表达,通过测定样品Flu来量化体外的相对活性值;依据5'-UTR的碱基分布、最小自由能等对文库序列特征进行分析;将得到的体内外真实活性值进行相关性分析并计算皮尔逊相关系数.结果:成功构建的554个5'-UTR变体文库在体内外蛋白质表达系统中表现出中等相关性(Pearson'r=0.64);其中,相对活性值高的5'-UTR序列富含AG,并且其在体内外均呈现自身最小自由能较大,而与16S rRNA杂交的自由能较小;文库数据量大小使体内外相关性分析产生一定的波动性但较为微弱;最后,发现高活性区间内的5'-UTR序列在体内外相关性较高,并从文库中优选出3条作为通用型5'-UTR应用于代谢工程与合成生物学领域.结论:体内外蛋白质表达的中等相关性推动了体外快速表征在研究体内生物合成中的拓展与应用,筛选出的通用型5'-UTR为基因线路的遗传设计提供了选择.

[目的]研究西蒙得木HSP20 家族成员的结构和功能,为后续研究提供支撑.[方法]从结构分析、系统发育、表达模式等方面对西蒙得木HSP20 家族成员(ScHSP20s)进行系统分析,并对ScHSP20-17 进行功能分析.[结果]西蒙得木基因组中包含 35 个HSP20 基因座位,其中 8 个基因涉及串联重复,5 个涉及片段重复.系统发育分析表明,35 个ScHSP20 聚为 12 个亚家族,其中核质亚家族数量最多.启动子分析表明,多数ScHSP20 家族成员启动子区域含有激素响应和非生物胁迫等相关顺式作用元件.转录组分析表明,ScHSP20-35 和ScHSP20-17 等部分热激蛋白基因在花和种子发育过程中表达量发生显著性改变,而ScHSP20-17 和ScHSP20-28 等基因受高温诱导.亚细胞定位分析表明,ScHSP20-17 编码的蛋白定位于细胞核中,并且在大肠杆菌、酵母和烟草中过表达ScHSP20-17 能显著提高它们对高温胁迫的耐受性.[结论]部分ScHSP20 家族成员参与了西蒙得木生殖发育和非生物胁迫应答.