目的:寻找散发先天性心脏病(CHD)致病基因SOX7新突变并研究其功能.方法:选取116例散发CHD患儿和228名无CHD对照儿童,对其SOX7基因进行测序分析,以发现新的致CHD突变.克隆SOX7基因并构建野生型人SOX7表达质粒,通过定点诱变产生突变型人SOX7表达质粒,使用脂质体转染多种表达质粒入HeLa细胞,应用双报告基因定量分析突变的功能效应.结果:在1例男性散发先天性室间隔缺损患儿中发现了SOX7基因新突变,即NM_031439.4:c.361C＞T;p.(Gln121*)突变;在其他115例CHD患儿和228名无CHD对照者中未检测出该突变.双报告基因定量研究表明,突变型人SOX7对其关键靶基因GATA4的转录激活作用消失.结论:SOX7基因突变可能是一部分散发CHD的病因,这对CHD的个体化防治有潜在的临床意义.

目的:寻找孤立性心房颤动(房颤)致病基因TBX20 新突变并研究其功能.方法:测序分析 182 例孤立性房颤患者和 236 名无房颤对照者的TBX20 基因,以发现新的致房颤突变.克隆人TBX20基因,构建野生型TBX20 表达质粒,通过定点诱变制备突变型TBX20表达质粒,借助脂质体将表达质粒转染HeLa细胞,应用双荧光素酶报告基因分析系统研究突变体的功能特性.结果:在 1 例散发性孤立性房颤患者中发现TBX20 基因新突变,即NM_001077653.2:c.706A＞T;p.(Lys236*)突变.该突变不存在于其他孤立性房颤患者和对照者.功能研究显示突变型TBX20 对靶基因KCNH2 的转录激活作用丧失.结论:TBX20基因功能障碍可能是部分房颤患者的分子病因,这对房颤的精准防治有潜在临床意义.

目的:探讨先天性室间隔缺损致病基因SOX18 的新突变.方法:收集 156 例先天性心脏病患儿和 216 名无先天性心脏病对照者的临床数据和血液样本,提取基因组DNA,测序分析SOX18基因以识别新的致病突变.克隆SOX18基因,构建野生型SOX18表达载体,通过定点诱变产生突变型SOX18表达载体,转染HeLa细胞,应用双报告基因定量分析突变体的功能.结果:在 1 例散发性先天性室间隔缺损患儿中发现SOX18 基因新突变,即NM_018419.3:c.430C＞T;p.(Gln144*)突变.该突变不存在于其他先天性心脏病和对照者患儿.双报告基因定量分析表明突变型SOX18对靶基因NR2F2的转录激活作用丧失.结论:SOX18基因功能缺失性突变可能是部分先天性室间隔缺损的分子病因,这对先天性室间隔缺损的的精准防治具有潜在的临床意义.

目的:构建模型用于评估戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)突变衣壳蛋白与细胞的结合作用以及各氨基酸位点在细胞结合过程中的作用,探讨HEV的入侵机制,为研究HEV的受体奠定基础.方法:以D66的基因四型重组类病毒颗粒样抗原为研究对象,对其关键结构域位点的氨基酸进行定点突变,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法确认突变蛋白的正常构象,并通过流式细胞仪分析突变蛋白对吸附的影响,探讨影响病毒吸附入胞的关键位点.结果:通过聚合酶链式反应定点诱变技术成功制备并鉴定了 45个正确折叠、构象正常的突变蛋白;ELISA检测结果显示,重组类病毒颗粒样抗原D66的单点突变并不会影响蛋白构象;应用模型模拟突变蛋白与细胞的结合过程,T484A、S488A、T489A、P491A、R512A、Y561A、N562A和T585A突变蛋白显著影响了对C3A的吸附.结论:成功建立了一种评估HEV衣壳蛋白与细胞结合性的模型,T484A、S488A、T489A、P491A、R512A等位点的丙氨酸突变显著减弱了HEV衣壳蛋白与细胞的结合,这些位点可能是影响HEV与细胞结合的关键位点.

基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一.为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区(Tm =50±2℃)和非重叠区(Tm=60±2℃),并在严格控制模板用量(2 pg/kb)的基础上,通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增,随后取0.5μL产物直接用于转化.在FastPfu Fly酶系中,利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒,均获得成功,突变效率可达96％以上,阳性克隆获得数达70个以上.此外,利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价,结果表明突变效率均可达93％以上,阳性克隆获得数均在10个以上.通过适当增加PCR模板用量(10 pg/kb)并使用纯化后的PCR产物进行转化,该法可适用于转化效率大于106(cfu/μg)的任意感受态细胞,对应的突变效率可大于91％,阳性克隆获得数大于20.根据本法的作用原理,该方案适合质粒中1O～ 20 bp(因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变)以内的任意碱基替换和插入,以及任意长度的DNA片段缺失.且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点,适合各实验室的日常研究使用.

为明确牙鲆雄性性别相关关键基因dmrt1 (doublesex and mab-3-related transcription factor 1)是否为pol-miR-26a、pol-miR-26b作用的靶基因,本研究利用PCR技术克隆了dmrt13'UTR区,并成功引入了特殊限制性内切酶PemⅠ和NotⅠ的识别位点;将得到的dmrt1 3'UTR区片段和psiCHECK-2载体进行双酶切、连接后得到野生型重组质粒;并且利用定点诱变法对dmrt1 3'UTR区进行体外定点诱变,将pol-miR-26a、pol-miR-26b识别的靶序列ACTGAA突变为TGACTT,形成突变型重组质粒.经琼脂糖凝胶电泳鉴定、双酶切及测序分析,成功获得了可用于pol-miR-26a、pol-miR-26b的靶基因dmrt1验证的野生型psiCHECK-dmrt1-3'UTR和突变型psiCHECK-mutated dmrt1-3'UTR的报告质粒,为进一步研究pol-miR-26a、pol-miR-26b的靶基因dmrt1鉴定和功能奠定了基础.

目的 建立一种骨髓增生性疾病JAK2 V617F突变快速检测体系,并调查中国正常人群中JAK2 V617F突变发生率.方法 根据JAK2基因V617F位点DNA参考序列,分别设计靶序列扩增特异性引物、突变和野生型特异性TagMan探针,建立并优化基于实时定量荧光PCR技术的检测体系并对体系的灵敏度、特异性,重复性进行评价.同时,采用大引物定点诱变和直接克隆技术,构建相应的阴阳性质粒DNA,以形成包含检测方法与质控品的完整应用体系.结果 建立了骨髓增生性疾病JAK2 V617F突变快速检测体系,此体系与传统Sanger测序比较,灵敏度和特异性均为100％,批内变异系数为0.006.同时,对1000份正常样本进行检测,检出JAK2 V617F突变1例,人群携带率1‰.结论 本研究建立的检测体系操作简单、快速准确,低成本高通量,可应用于常规临床检测.JAK2 V617F突变是一种罕见突变,但在骨髓增生性疾病患者中应作为首先检测位点.

目的 探讨心脏高表达基因hhole调控心肌肥厚信号分子ANF的转录活性的分子机制.方法 利用生物信息学在线软件分析hhole蛋白的分子结构.利用酶切法和环状诱变技术突变得到hhole基因的突变体重组质粒.将突变体和野生型的重组质粒分别转染HEK293细胞系,测定荧光素酶报告基因ANF的转录活性.结果 生物信息学分析发现hhole蛋白含有ERK结合位点和多聚脯氨酸序列.利用酶切法构建了4个截短突变体重组质粒,环状质粒定点诱变的方法构建了3个定点突变的突变体.荧光报告系统分析发现pCMV-tag2B-TD与pCMV-tag2B-hhole全长均能强烈地抑制ANF的转录活性.结论 hhole蛋白主要通过其ERK结合位点抑制心肌肥厚信号分子ANF的转录活性.

目的 探究雷公藤内酯通过CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancerbinding proteinα,C/EBPα)抑制狼疮样肾炎小鼠IL-12/IL-23表达的机制.方法 实验分为3组:对照组(健康小鼠,n=15)、MRL/lpr组(狼疮样肾炎小鼠,n=15)和雷公藤内酯组(狼疮样肾炎小鼠经雷公藤内酯治疗,0.125 mg/kg/2 d,n=15);使用HITACHI-7 080自动生化分析仪检测血清尿素氮和肌酸酐水平;用苏木素-伊红染色进行肾组织病理学测定,评估肾小球肾炎,间质性肾炎和血管病变的组织学评分;通过逆转录-实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印记分析了肾脏中炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-12和IL-23)mRNA和蛋白质表达;通过定点诱变将碱基取代检测IL-12/IL-23启动子活性;通过ChIP测定小鼠C/EBP结合活性.结果 与对照组(8.47±0.85,15.38± 1.06)相比,MRL/Ipr组尿素氮(29.14±2.05)和肌酸酐(40.18±3.72)水平增加(P＜0.05),雷公藤内酯(11.36±1.23,20.17±2.45)治疗降低MRL/lpr小鼠尿素氮和肌酸酐水平(P＜0.05);MRL/Ipr组中的小鼠表现出肾损伤,组织学评分均增加(P＜0.05),其特征在于系膜基质增加,管状铸型沉积和间质细胞浸润.相反,在雷公藤内酯处理的小鼠中这些病理特征改善;MRL/lpr组较对照组炎性细胞因子的mRNA和蛋白质表达增加(P＜0.05).雷公藤内酯降低了MRL/lpr小鼠中TNF-α、IL-6、IL-12和IL-23 mRNA和蛋白质表达(P＜0.05);C/EBP的突变缓解雷公藤内酯对小鼠IL-12/IL-23启动子活性的抑制.结论 雷公藤内酯通过C/EBP α抑制IL-12/IL-23的表达来改善MRL/lpr小鼠中的狼疮样肾炎.

利用一对寡核苷酸引物，肘含有αl一抗胰蛋白酶（α 1-AT）cDNA基因的质粒进行定点诱变，使358 Met-ATG突变为Arg-AGG。经过Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定，表明α 1-AT被成功地定点突变。将突变得到的α 1-AT Pitts基因克隆入pBV220载体中并进行表达，得到了有抗原活性的凝血酶抑制剂a 1-AT Pitts表达产物。以一对引物代替两对引物，节省了引物合成的费用，方法简便、快速、经济。