目的 探索环状RNA mmu_circ_0005019调控小电导钙激活钾(small-conductance calcium-activated potassium,SK)通道蛋白亚基SK3编码基因Kcnn3的表达,以及对小电导钙激活钾通道电流(IK,Ca)和动作电位时程(action potential duration,APD)的影响.方法 在小鼠HL-1细胞中分别构建mmu_circ_0005019过表达和干扰模型,分为过表达组(n=3)、空质粒组(n=3)、干扰1组(n=3)、干扰2组(n=3)、对照组(n=3),通过RT-qPCR、Western blot分析mmu_circ_0005019调节Kcnn3表达的分子机制,应用膜片钳技术电流钳模式记录全细胞的IK,Ca,并用电压钳模式记录APD.结果 成功构建了环状RNA mmu_circ_0005019过表达和干扰的HL-1细胞模型.过表达组的Kcnn3基因表达与空质粒组相比明显上调(P<0.05);干扰1组和干扰2组的Kcnn3基因表达与对照组相比均明显下调(P<0.05).电生理发现过表达mmu_circ_0005019增加了HL-1细胞IK,Ca电流密度,APD显著缩短;相反,干扰mmu_circ_0005019减少了IK,Ca电流密度,APD显著延长.结论 mmu_circ_0005019可以上调小鼠HL-1细胞Kcnn3的表达水平,从而改变IK,Ca和APD,提示环状RNA mmu_circ_0005019可能在房颤发生中起到促进作用.

目的 探讨小G蛋白Rab5对HEK293细胞大电导钙激活钾通道(BKCa)的影响.方法 将对数生长期HEK293细胞,随机分为Control组、Rab5WT组、Rab5CA组和Rab5DN组.采用脂质体转染法进行转染,Control组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和对照质粒pcDNA3.1,Rab5WT组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5WT质粒,Rab5CA组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5CA质粒,Rab5DN组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5DN质粒,每组两种质粒总量为4μg,按质量比1∶1共转染至3.5 mm培养皿中.转染72 h、荧光显微镜下观察转染效率在70％以上时,采用膜片钳、Western blotting法和流式细胞术观察Rab5对HEK293细胞BKCa的作用.结果 与Control组比较,Rab5WT组、Rab5CA组BKCa全细胞电流密度明显增加,而Rab5DN组明显降低;Rab5WT组、Rab5CA组BKCa膜蛋白的相对表达量明显升高,而Rab5DN组明显降低(P均＜0.05);Rab5WT组、Rab5CA组Flag+/GFP+明显增加,而Rab5DN组明显降低(P均＜0.05).结论 Rab5能够明显增加表达在HEK293细胞上的BKCa电流及细胞膜上的表达,并可促进BKCa向质膜的转运过程.

目的:探讨小电导钙激活钾通道3(SK3)表达在17β-雌二醇(E2)介导的大鼠结肠平滑肌收缩中的作用及机制.方法:将24只雄性SD大鼠随机分为4组.30 mm硅胶管皮下植入大鼠背部,内含不同溶液.分为对照组(C),内含溶剂;生理剂量组(EP)内含E2 0.3 mg/mL,使大鼠血清雌激素在生理浓度;超剂量组(ES)内含E2 0.9 mg/mL,使大鼠血清雌激素超生理浓度;ER抑制剂+E2组(EI)内含相同摩尔浓度E2和雌激素受体抑制剂(ICI 182780).各组干预14d后处理,免疫荧光及West-em blot检测结肠平滑肌组织SK3分布及表达;MPA分析系统记录肌条收缩张力及对卡巴胆碱(Cch)刺激反应.E2孵育结肠平滑肌细胞(SMC)24 h后及过表达SK3后,激光共聚焦显微镜下动态观察Cch刺激后SMC内Ca2+变化.结果:Cch刺激后,EP组及ES组肌条收缩明显低于其他各组(P＜ 0.05).EP组及ES组平滑肌组织SK3表达高于C组及EI组,其中ES组有统计学意义(P＜0.05).Cch刺激后,E2孵育组及过表达SK3组胞内Ca2+上升幅度较相应对照组显著降低(P＜0.05).结论:E2可能通过促进SK3表达,减少Ca2+内流从而抑制结肠收缩.

线粒体由内外两层膜封闭而成,其中线粒体内膜作用极为重要,呼吸链蛋白复合体附着于线粒体内膜,同时于此完成其生理功能.目前,线粒体内膜已鉴定出多种钾离子通道蛋白,如线粒体选择性钾离子通道,包括ATP依赖钾通道(mitoKATP)、电压依赖性钾通道(mitoKv 1.3)、小电导钙离子激活钾通道(mitoSKCa)、中电导钙离子激活钾通道(mitoIKCa)、大电导钙离子激活钾通道(mitoBKQ)、pH依赖钾离子通道(mitopH-sensitive K+ channels)以及TASK-3双孔钾通道(mitoTASK-3)[1-2].其中,Xu等[3]于2002年首次发现mitoBKCa在心血管疾病中扮演着极为重要的角色.随着对mitoBKCa研究的深入,发现mitoBKCa在细胞凋亡等多种生理、病理活动中也起着重要作用[4].笔者对mitoBKCa结构与功能研究的进展进行一个简要总结.

目的:探讨局部麻醉药布比卡因(Bupivacaine)对中电导钙激活的钾通道(IKCa)的调控作用.方法:体外培养KG1a细胞,PCR检测IKCa基因KCNN4和小电导钙激活的钾通道基因KCNN1-3的表达,全细胞膜片钳方法检测游离Ca2+浓度为1 mmol/L的电极内液条件下,破膜前后钾电流变化,并分别观察bupivacaine和IKCa阻断剂Clotrimazole对其的影响.结果:KG1a细胞表达KCNN4 mRNA,但不表达KCNN1-3基因;在全细胞记录模式下,刚破膜时记录到微弱钾电流,3 min后电流幅度明显增大,同时细胞膜电位由(-22.4±2.3)mV超极化至(-64.3±3.7)mV(P＜0.01);IKCa阻断剂Clotrimazole(1 mmol/L)作用后,最大电流下降至对照的(34±5)％(P＜0.05);bupivacaine(1 mmol/L)作用后的电流下降至对照的(28±5)％(P＜0.05),该抑制作用可以部分被洗脱.挥发性麻醉剂halothane作用后的KCa电流下降至对照的(30±4)％(P＜0.05),但BKCa通道抑制剂四乙铵(TEA,1 mmol/L)对KCa无明显抑制作用(P＞0.05).结论:IKCa电流是KG1a细胞的主要KCa电流成分,bupivacaine可以显著抑制IKCa电流.

目的 研究增龄对人心房肌小电导钙激活钾(SK2)通道的影响.方法 选取3个不同年龄阶段:<40岁(n=22)、40～60岁(n=34)和>60岁(n=18)窦性心律(SR)患者为研究对象,于体外循环手术中获取患者右心耳组织.急性酶分离方法分离单个人心房肌细胞,全细胞膜片钳技术检测不同年龄患者心房SK2通道电流的差异.Western blot和qRT-PCR检测不同年龄患者心房组织SK2通道蛋白和基因的表达变化.结果 采用该急性酶分离方法可获得细胞完整、横纹清晰、有电生理活性的心房肌细胞;<40岁患者组(n=18)与40～60岁患者组(n=8)相比,SK2通道电流无明显变化(P>0.05),与<40岁患者组(n=8)相比,>60岁患者组(n=10)SK2通道电流明显增加(-130 mV,P<0.01);与40～60岁患者组(n=8)相比,>60岁患者组(n=10)SK2通道电流也增加且差异有统计学意义(-130 mV,P<0.01).分别与<40岁(n=12)和40～60岁患者组(n=18)相比,>60岁患者组(n=10)SK2通道蛋白表达和基因表达均明显增加(P<0.05).结论 随着年龄的增加,人心房组织中SK2通道电流、基因和蛋白表达水平均明显增加,增龄导致的SK2通道重构可能参与了心房颤动的病理生理过程.

采用Real-time PCR、Western blot及免疫组化检测中电导钙激活钾离子通道蛋白(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel protein,SK4/Kca3.1/KCNN4)在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)组织及细胞株中的表达情况,同时,对比研究SK4蛋白表达与PTC临床病理特征的关系.通过SK4特异性抑制剂(TRAM-34)下调SK4的表达后,采用CCK-8、平板克隆实验及Transwell实验分别检测SK4对PTC细胞株CGTHW-3增殖、集落形成及迁移能力的影响并分析其可能的分子机制.Real-time PCR、Western blot结果显示,SK4在PTC组织中的mRNA及蛋白表达量均明显高于癌旁组织(P＜0.01).免疫组化结果显示,SK4的阳性率明显高于正常甲状腺组织(P＜0.01),而SK4蛋白表达阳性率与PTC患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理特征之间并无显著统计学意义(P＞0.05).TRAM-34可通过阻断SK4通道抑制CGTHW-3细胞的增殖、集落形成能力及迁移能力.以上结果提示,SK4通道在PTC组织及细胞中高表达,参与调控PTC细胞的增殖及迁移过程,可能与PTC发病的分子机制有关.SK4有可能成为PTC新的治疗靶点.

目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1).方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用West?ern印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果.结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1.结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法.

目的 探讨血管紧张素(Ang) (1-7)在肾纤维化过程中的保护作用与中电导钙激活钾离子通道(KCa3.1)的关系.方法 60只雄性小鼠随机分为5组:对照组(WT);血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)组:皮下注射AngⅡ[1.4 mg/(kg.d)];注射AngⅡ的同时给予以下药物干预:AngⅡ阻断剂洛沙坦(Losartan)组:皮下注射Losartan[40 mg/(kg.d)];Ang (1-7)组:皮下注射Ang(1-7) [0.14 mg/(kg.d)];血管紧张素转化酶2(ACE2)激动剂重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐(DIZE)组:皮下注射DIZE[10 mg/(kg.d)].连续给药4周后对相关指标进行检测.Masson染色法检测肾组织胶原沉积变化;Western blotting法检测肾组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和KCa3.1通道蛋白表达的变化.结果 与对照组相比,AngⅡ组小鼠肾组织内胶原沉积量明显增加(n=12,P＜0.01),表明肾纤维化模型复制成功.AngⅡ使肾组织Ⅰ、Ⅲ型胶原合成显著增多(n=6,P＜0.01),同时促进了肾组织KCa3.1通道蛋白的表达(P＜0.01),而Ang (1-7)及ACE2激活剂DIZE的应用抑制了肾组织内胶原沉积量、Ⅰ/Ⅲ型胶原合成及KCa3.1通道蛋白的表达(n=12或6,P＜0.01).结论 Ang (1-7)在肾纤维化过程中发挥保护作用,这一作用可能与其下调肾组织中KCa3.1通道蛋白表达有关.

目的 探讨豚鼠D-半乳糖衰老模型耳蜗血管纹周细胞大电导钙激活钾离子通道(large conductance calcium-activated potassium channels,BKCa)的表达和功能变化及其与年龄相关性听力损失的关系.方法 30只8周龄健康豚鼠按完全随机法分为三组,每组10只:D-半乳糖衰老模型组,每天颈部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg),连续6周;生理盐水对照组:每天颈部皮下注射与衰老模型组同体积生理盐水,连续6周;空白对照组:不做任何处理.造模结束后检测各组豚鼠听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值;通过免疫荧光技术检测各组豚鼠耳蜗血管纹周细胞上BKCa的表达情况;利用膜片钳技术检测周细胞电流密度及BKCa电流的变化情况.数据采用GraphPad Prism软件进行统计分析.结果 与生理盐水组和对照组相比,衰老模型组豚鼠ABR阈值升高且Ⅰ波振幅明显降低,差异均具有统计学意义(P值均<0.01).与对照组相比,衰老模型组豚鼠血管纹周细胞上BKCa的表达明显减少(1.00±0.08 vs 0.27±0.03,差异有统计学意义,P<0.01),周细胞电流密度和BKCa净电流值亦明显减小(差异均具有统计学意义,P值均<0.01).结论 D-半乳糖可成功诱导豚鼠衰老模型,其耳蜗血管纹周细胞上BKCa表达下降、净电流值减小,BKCa表达和功能的变化可能与年龄相关性听力损失有关.