目的 研究旋毛虫原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)过表达对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)NCI-H446细胞蛋白组分的影响.方法 本研究通过串联质谱标记(Tandem mass tags,TMT)技术结合生物信息学分析旋毛虫Tm过表达对NCI-H446细胞蛋白组分的影响.比较旋毛虫Tm(Tm-pcDNA3.1)过表达和转染空载体(pcDNA3.1)48 h后NCI-H446细胞的蛋白组分,利用Uniprot数据库检索差异表达蛋白(Differentially expressed protein,DEPs)并对所得DEPs进行基因本体论(GO)富集分析.从STRING数据库获得DEPs相互作用数据,利用Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白互作网络并筛选中心节点蛋白.通过Western blot对随机选取的中心节点蛋白NDRG1进行验证.结果 旋毛虫Tm转染NCI-H446细胞48 h后,筛选出DEPs 70个,其中34个上调,36个下调;GO功能富集分析显示,DEPs主要涉及转录后的调控、免疫应答的调节等生物学功能;分析蛋白互作网络获得5个下调的中心节点蛋白:细胞周期蛋白G相关激酶(GAK)、组蛋白H3-7(H3-7)、辛普勒金Symplekin(SYMPK)、N-myc下游调节因子1(NDRG1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N2(PKN2);Westrne blot结果显示旋毛虫Tm降低NCI-H446细胞中NDRG1的表达.结论 旋毛虫TM能引起NCI-H446细胞蛋白组分的显著变化;旋毛虫Tm可能通过下调NCI-H446细胞中GAK、H3-7、SYMPK、NDRG1、PKN2的表达发挥其生物学作用.

目的 研究CXCR4-siRNA对小细胞肺癌细胞NCI-H446体外侵袭力的影响.方法 根据siRNA的设计原则化学合成CXCR4特异性siRNA,用脂质体转染NCI-H446细胞,采用RT-PCR法及Western Blot法检测CXCR4 mRNA及蛋白水平的变化.用Transwell小室模型检测转染后细胞体外侵袭能力的变化,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化.结果 转染CXCR4-siRNA后,CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下降,细胞体外侵袭能力明显减弱,CXCR4-siRNA转染组趋化侵袭实验穿膜细胞数(32.3±3.8)较空脂质体转染组(62.1±8.2)明显减少(P<0.001),CXCR4-siRNA对NCI-H446细胞增殖无影响.结论 特异的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低小细胞肺癌细胞的体外侵袭能力.

目的:研究小白菊内酯(parthenolide,PTL)对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)细胞株NCI-H446增殖及凋亡作用的影响及其可能的分子机制.方法:NCI-H446细胞株由武汉大学细胞库提供,PTL购于Gene Operation公司,将NCI-H446细胞株分为对照组和实验组(1.5 μg/mL组、2.0 μg/mL组、2.5 μg/mL组和3.0μg/mL组),向实验组细胞培养基中加入对应浓度PTL处理细胞,对照组中加入等体积无血清培养基.MTT比色法观测不同浓度PTL对NCI-H446细胞增殖的影响;Hochest 33258染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态学变化;流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞凋亡率;RT-PCR分别检测不同浓度组PTL处理48 h后细胞中NF-kB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达状态,Wsetem blot检测NF-κB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达状态.结果:PTL抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖并呈浓度依赖性;Hochest 33258染色结果显示,PTL作用NCI-H446细胞48 h后,细胞数量减少,细胞核固缩碎裂,形成凋亡小体,导致细胞凋亡;流式细胞术检测显示,PTL处理NCI-H446细胞后,细胞凋亡率与药物浓度梯度呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR及Wsetern blot结果显示,与对照组比较,经PTL处理的NCI-H446细胞中NF-κB mRNA及蛋白表达下调,同时Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA及蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:PTL能抑制NCI-H446细胞的增殖并诱导其发生凋亡,PTL的作用机制可能与抑制NF-κB信号通路及活化Caspase系统有关.

目的:研究锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)沉默对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞体外致瘤性的影响及其潜在的机制.方法:采用悬浮培养法得到人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞,用Western印迹分析MnSOD和尿激酶型纤溶原酶激活物(urokinase type plasminogen activator,uPAR)表达.利用腺病毒感染技术沉默NCI-H446细胞MnSOD,球形成法和软琼脂集落形成法评价MnSOD沉默对NCI-H446球细胞体外致瘤性的影响,用Western印迹检测uPAR的表达.结果:与NCI-H446细胞比较,NCI-H446细胞第2代球细胞的球形成率和集落形成率及MnSOD和uPAR表达明显增加(P＜0.05).表达shMnSOD的腺病毒抑制NCI-H446细胞第2代球细胞球形成率、集落形成率及uPAR的表达.结论:MnSOD可能通过调控uPAR表达维持小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞的体外高致瘤性.

目的:观察HA14-1及其联合顺铂对人小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡诱导作用并探讨其可能的作用机制,探讨其对Bcl-2、Bax表达的的影响.方法:选用人小细胞肺癌NCI-H446细胞株为研究对象,分为空白组、DDP组、HA14-1组及DDP+ HA14-1组,分别作用24、48 h后,采用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,Real time PCR法比较细胞内Bcl-2、Bax表达变化.结果:随着HA14-1及DDP浓度的增加,细胞抑制率逐渐增加,细胞凋亡率增高,联合用药组较单独用药组细胞的抑制率,凋亡率均增高,HA14-1作用细胞后,Bcl-2表达水平下降,Bax表达水平增高.结论:HA14-1可以诱导人小细胞肺癌凋亡,并增加肺癌细胞对DDP的化疗作用.

目的 探究细胞增殖抑制基因(HSG)、WNT5A、WNT11对人小细胞肺癌NCI-H446细胞成瘤的影响并探讨其作用机制.方法 采用裸鼠成瘤技术在裸鼠皮下培养NCI-H446细胞肿瘤组织,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测成瘤组织与癌旁组织中HSG、WNT5A、WNT11基因的相对表达量.结果 20只接种NCI-H446细胞悬液的裸鼠中,1只裸鼠于操作过程中死亡,15只裸鼠成功成瘤,成瘤率为78.9％.肿瘤组织中WNT5A、WNT11基因的相对表达量明显高于癌旁组织(P﹤0.01);肿瘤组织中HSG基因的相对表达量明显低于癌旁组织(P﹤0.01).结论 HSG基因可能具有抑制小细胞肺癌成瘤的作用,WNT/Ca2+信号通路在NCI-H446细胞成瘤组织中大量开放并可能参与其成瘤过程.

目的:探讨同源重组修复途径关键调控蛋白SPIDR在小细胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC) 中的作用与机制.方法:收集2013年1月至2015年1月上海肺科医院进行肿瘤手术切除、气管镜穿刺的SCLC患者癌组织标本60例及正常人群肺组织标本44例, qRT-PCR检测临床组织样本SPIDR mRNA表达水平;经稳定过表达SPIDR改变NCI-H446细胞表达水平后, 采用MTT、小鼠荷瘤实验等实验方法, 在体内、体外探究SPIDR表达水平对SCLC细胞增殖等影响.结果:吸烟与患者SCLC的发生显著有关 (P<0.01);SPIDR m RNA在SCLC组织样本中的表达显著低于正常肺组织 (P<0.01) .人肺胚成纤维细胞株MRC-5中SPIDR mRNA和蛋白表达水平明显高于SCLC细胞株NCI-H446 (均P<0.05) .在10％胎牛血清常规培养体系中, 过表达SPIDR对NCI-H446细胞增值和化疗药物敏感性无明显影响 (均P>0.05), 但小鼠荷瘤实验从第9天开始, 过表达SPIDR组 (pMSCV-SPIDR) 的瘤体积与原始NCI-H446组和空载体组 (pMSCV) 开始出现明显差异, 第27天pMSCV-SPIDR组移植瘤平均体积分别比原始NCI-H446组与空载体组缩小58.99％和61.84％ (均P<0.01) .在含1％～3％胎牛血清的非常规培养体系中, 过表达SPIDR的NCI-H446细胞增殖速度显著低于原始NCI-H446组和空载体组 (P<0.05或P<0.01) .结论:SCLC组织中SPIDR表达水平明显低于正常肺组织, 过表达SPIDR的NCI-H446细胞体内及体外低血清含量培养 (<3％) 生长速度显著低于对照组, 表明SPIDR以低血清浓度依赖方式影响SCLC细胞增殖.

目的 探讨射频消融形成的消融灶周边移行区域内缺氧诱导因子1 a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)的表达情况,以及HIF-1a表达对移行区域内小细胞肺癌微转移瘤增殖及免疫反应的影响.方法 骨髓腔注射人NCI-H446小细胞肺癌细胞建立转移性人小细胞肺癌裸鼠模型,30 d后经皮穿刺行右肺上叶RFA处理,同时腹腔注射HIF-1a特异性抑制剂3-(5'-羟甲基-2'呋喃基)-1-苯甲基吲唑(YC-1)抑制其表达,7d后观察各组指标.实验分为未处理组(对照组)、YC-1处理组,RFA处理组、RFA+YC-1组.将消融形成的中央坏死灶移行至正常肺组织2～3 mm的区域定义为移行区域,检测此区域内微转移瘤的负荷率(PRA),免疫组织化学法检测HIF-1a蛋白水平.切取坏死灶周边2～3 mm厚的组织切片,Reahime PCR检测HIF-1a和血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)mRNA表达.结果 建模成功的裸鼠可见明显的人小细胞肺癌转移瘤分布.RFA组中右肺上叶移行区域内转移瘤的PRA值及HIF-1a,表达水平均明显高于右肺上叶对照区域(P＜0.05),亦高于对照组右肺上叶移植瘤组织(P＜0.05),此外RFA+YC-1组移行区域内PRA值及HIF-1a明显低于RFA处理组(P＜0.05).虽然RFA+YC-1组移行区域和对照区域内的VEGF-A mRNA表达水平明显均低于RFA组(P＜0.05),但是RFA组移行区域及对照区域内的VEGF-A mRNA表达无显著差异(P＞0.05).结论 小细胞肺癌在接受射频消融处理后消融灶周边的肿瘤局部复发现象与移行区域内HIF-1a表达密切相关,但这一过程与HIF-1a介导的血管生成效应无明显关系,而与HIF-1a参与调控的肿瘤免疫反应可能存在相关性.

为了开发利用绿潮藻类条浒苔中含量丰富的蛋白质,采用木瓜蛋白酶酶解条浒苔蛋白,最佳酶解条件为:料液比1:25、加酶量1250 U/g pro、温度45.7℃、pH 7.2、震荡酶解时间120 min.在该条件下的酶解多肽经超滤分离获得不同分子量区间的多肽,并通过HUVEC、A549、H446、H460等细胞水平初步评价酶解条浒苔制备多肽抗肺癌的细胞生物学效果.结果表明,经上述条件获得的2-6 kD条浒苔多肽处理的HUVEC在抗氧化和小管形成等方面均受到抑制,其处理的NCI-H460、NCI-H446和A549的增殖、细胞周期、迁移也受到不同程度抑制,且能够促进细胞凋亡;2-6 kD浒苔多肽对H446、H460作用效果显著优于对A549的作用.这一细胞水平研究,不仅证实了酶解条浒苔获取新型天然抗肿瘤小肽的可行性,也为条浒苔蛋白质资源高值化利用探索提供了新的途径.

目的:研究哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)新型小分子抑制剂Torin-2对人小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖及凋亡的影响并探讨其机制.方法:体外培养并取对数生长期人小细胞肺癌NCI-H446细胞,分别给予不同浓度Torin-2或1 μmol/L处理不同时间,然后于镜下观察细胞离巢凋亡,通过克隆形成实验检验细胞生长抑制,采用MTS比色法测定吸光度值并计算相对细胞活性,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p-Akt(Ser473)、Cyclin-B1、Cyclin-D1、Cyclin-E1、Cleaved Caspase-3等相关蛋白表达.结果:与对照组相比,Torin-2可有效抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖及相对细胞活性(P＜0.05);诱导细胞周期阻滞(P＜0.05);抑制p-mTOR、p-Akt磷酸化激活,降低Cyclin-D1、Cyclin-E1等细胞周期蛋白表达并诱导Cleaved Caspase-3蛋白激酶切割激活.结论:Torin-2可能通过抑制Akt-mTOR相关信号通路和激活凋亡相关蛋白诱导人小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖抑制并促进其凋亡.