目的 探究Survivin对小细胞肺癌依托泊苷耐药细胞株增殖和凋亡的影响及机制.方法 构建小细胞肺癌细胞NCI-H82和NCI-H446依托泊苷耐药细胞株(NCI-H82/ER和NCI-H446/ER),检测NCI-H82/ER和NCI-H446/ER的IC50及耐药指数,qRT-PCR和蛋白质印迹检测细胞株中Survivin表达.NCI-H82/ER和NCI-H446/ER细胞中转染Survivin siRNA(si-Survivin组)或Survivin siRNA Negative Control(si-NC组),CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹检测PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平.结果 NCI-H82/ER和NCI-H446/ER的IC50分别为154.5μmol/L和130.5μmol/L,耐药指数分别为5.40和6.21.相比于NCI-H82和NCI-H446细胞,NCI-H82/ER和NCI-H446/ER细胞中Survivin mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.001),相比于si-NC组,si-Survivin组NCI-H82/ER和NCI-H446/ER细胞增殖能力显著降低(P<0.05),凋亡水平显著增加(P<0.001),PI3K、AKT、mTOR磷酸化均显著降低(P<0.001).结论 抑制Survivin可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路影响依托泊苷耐药小细胞肺癌细胞的增殖和凋亡.

目的 研究旋毛虫原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)过表达对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)NCI-H446细胞蛋白组分的影响.方法 本研究通过串联质谱标记(Tandem mass tags,TMT)技术结合生物信息学分析旋毛虫Tm过表达对NCI-H446细胞蛋白组分的影响.比较旋毛虫Tm(Tm-pcDNA3.1)过表达和转染空载体(pcDNA3.1)48 h后NCI-H446细胞的蛋白组分,利用Uniprot数据库检索差异表达蛋白(Differentially expressed protein,DEPs)并对所得DEPs进行基因本体论(GO)富集分析.从STRING数据库获得DEPs相互作用数据,利用Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白互作网络并筛选中心节点蛋白.通过Western blot对随机选取的中心节点蛋白NDRG1进行验证.结果 旋毛虫Tm转染NCI-H446细胞48 h后,筛选出DEPs 70个,其中34个上调,36个下调;GO功能富集分析显示,DEPs主要涉及转录后的调控、免疫应答的调节等生物学功能;分析蛋白互作网络获得5个下调的中心节点蛋白:细胞周期蛋白G相关激酶(GAK)、组蛋白H3-7(H3-7)、辛普勒金Symplekin(SYMPK)、N-myc下游调节因子1(NDRG1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N2(PKN2);Westrne blot结果显示旋毛虫Tm降低NCI-H446细胞中NDRG1的表达.结论 旋毛虫TM能引起NCI-H446细胞蛋白组分的显著变化;旋毛虫Tm可能通过下调NCI-H446细胞中GAK、H3-7、SYMPK、NDRG1、PKN2的表达发挥其生物学作用.

目的 探讨miR-3195 通过调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞生长和转移的影响.方法 采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肺癌细胞H1299、A549、NCI-H446 中miR-3195 表达水平.将NCI-H446 细胞分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-3195 组(转染 miR-3195)、miR-3195+FH535 组(转染miR-3195+20 μmol/L通路抑制剂FH535).qRT-PCR检测miR-3195 表达水平;细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞增殖水平;Transwell检测细胞迁移和侵袭;Western印迹检测细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)4、细胞增殖核抗原(Ki)67、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达.结果 肺癌细胞H1299、A549、NCI-H446 中miR-3195 表达水平较正常肺上皮细胞BEAS-2B明显降低(P<0.05).miR-3195 组OD(48、72 h)值、迁移细胞数、侵袭细胞数、CDK4、Ki67、MP-2、MMP-9、Wnt3a、c-Myc、β-catenin蛋白表达明显低于miR-NC组(P<0.05).miR-3195+FH535 组OD(24、48、72 h)值、迁移细胞数、侵袭细胞数、CDK4、Ki67、MP-2、MMP-9、Wnt3a、c-Myc、β-catenin蛋白表达明显低于miR-3195 组(P<0.05).结论 miR-3195 可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭.

目的 研究CXCR4-siRNA对小细胞肺癌细胞NCI-H446体外侵袭力的影响.方法 根据siRNA的设计原则化学合成CXCR4特异性siRNA,用脂质体转染NCI-H446细胞,采用RT-PCR法及Western Blot法检测CXCR4 mRNA及蛋白水平的变化.用Transwell小室模型检测转染后细胞体外侵袭能力的变化,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化.结果 转染CXCR4-siRNA后,CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下降,细胞体外侵袭能力明显减弱,CXCR4-siRNA转染组趋化侵袭实验穿膜细胞数(32.3±3.8)较空脂质体转染组(62.1±8.2)明显减少(P<0.001),CXCR4-siRNA对NCI-H446细胞增殖无影响.结论 特异的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低小细胞肺癌细胞的体外侵袭能力.

目的:研究小白菊内酯(parthenolide,PTL)对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)细胞株NCI-H446增殖及凋亡作用的影响及其可能的分子机制.方法:NCI-H446细胞株由武汉大学细胞库提供,PTL购于Gene Operation公司,将NCI-H446细胞株分为对照组和实验组(1.5 μg/mL组、2.0 μg/mL组、2.5 μg/mL组和3.0μg/mL组),向实验组细胞培养基中加入对应浓度PTL处理细胞,对照组中加入等体积无血清培养基.MTT比色法观测不同浓度PTL对NCI-H446细胞增殖的影响;Hochest 33258染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态学变化;流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞凋亡率;RT-PCR分别检测不同浓度组PTL处理48 h后细胞中NF-kB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达状态,Wsetem blot检测NF-κB、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表达状态.结果:PTL抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖并呈浓度依赖性;Hochest 33258染色结果显示,PTL作用NCI-H446细胞48 h后,细胞数量减少,细胞核固缩碎裂,形成凋亡小体,导致细胞凋亡;流式细胞术检测显示,PTL处理NCI-H446细胞后,细胞凋亡率与药物浓度梯度呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR及Wsetern blot结果显示,与对照组比较,经PTL处理的NCI-H446细胞中NF-κB mRNA及蛋白表达下调,同时Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA及蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:PTL能抑制NCI-H446细胞的增殖并诱导其发生凋亡,PTL的作用机制可能与抑制NF-κB信号通路及活化Caspase系统有关.

目的:研究锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)沉默对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞体外致瘤性的影响及其潜在的机制.方法:采用悬浮培养法得到人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞,用Western印迹分析MnSOD和尿激酶型纤溶原酶激活物(urokinase type plasminogen activator,uPAR)表达.利用腺病毒感染技术沉默NCI-H446细胞MnSOD,球形成法和软琼脂集落形成法评价MnSOD沉默对NCI-H446球细胞体外致瘤性的影响,用Western印迹检测uPAR的表达.结果:与NCI-H446细胞比较,NCI-H446细胞第2代球细胞的球形成率和集落形成率及MnSOD和uPAR表达明显增加(P＜0.05).表达shMnSOD的腺病毒抑制NCI-H446细胞第2代球细胞球形成率、集落形成率及uPAR的表达.结论:MnSOD可能通过调控uPAR表达维持小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞的体外高致瘤性.

目的 探索HLA-G对C57BL/6-NCI-H446肺癌细胞荷瘤小鼠骨髓源性抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)增殖及M1/M2巨噬细胞分化的影响,进一步明确HLA-G在肿瘤免疫逃逸中的作用.方法 使用终浓度为1μmol/L羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记NCI-H446以及转染HLA-G的NCI-H446肺癌细胞,流式细胞术检测不同时间点细胞CFSE荧光强度,分析其增殖能力.通过C57BL/6小鼠皮下异位接种NCI-H446及HLA-G+NCI-H446肺癌细胞建立荷瘤小鼠模型.以注射PBS为空白对照组,每隔5 d解剖取材,流式细胞术分析各组小鼠脾脏MDSCs以及M1/M2细胞比例.结果 HLA-G转染的NCI-H446细胞稳定表达HLA-G蛋白(NCI-H446-G).HLA-G表达可促进NCI-H446细胞的增殖能力(P<0.05).C57BL/6小鼠在移植肿瘤细胞后,5 d内肿瘤生长最快,随时间增加肿瘤体积不断变小,但NCI-H446-G细胞成瘤组始终大于NCI-H446细胞组(P<0.05),且该组肿瘤在小鼠体内被完全排斥的时间大于NCI-H446细胞组.与PBS和NCI-H446组相比,NCI-H446-G组小鼠脾脏MDSCs比例显著升高(P<0.05),且M1/M2巨噬细胞比例显著降低(P<0.05).结论 HLA-G可影响荷瘤鼠内MDSCs增殖以及M1/M2巨噬细胞比例,参与荷瘤小鼠肿瘤免疫逃避,具有潜在的临床意义.

目的:观察HA14-1及其联合顺铂对人小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡诱导作用并探讨其可能的作用机制,探讨其对Bcl-2、Bax表达的的影响.方法:选用人小细胞肺癌NCI-H446细胞株为研究对象,分为空白组、DDP组、HA14-1组及DDP+ HA14-1组,分别作用24、48 h后,采用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,Real time PCR法比较细胞内Bcl-2、Bax表达变化.结果:随着HA14-1及DDP浓度的增加,细胞抑制率逐渐增加,细胞凋亡率增高,联合用药组较单独用药组细胞的抑制率,凋亡率均增高,HA14-1作用细胞后,Bcl-2表达水平下降,Bax表达水平增高.结论:HA14-1可以诱导人小细胞肺癌凋亡,并增加肺癌细胞对DDP的化疗作用.

目的 探究细胞增殖抑制基因(HSG)、WNT5A、WNT11对人小细胞肺癌NCI-H446细胞成瘤的影响并探讨其作用机制.方法 采用裸鼠成瘤技术在裸鼠皮下培养NCI-H446细胞肿瘤组织,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测成瘤组织与癌旁组织中HSG、WNT5A、WNT11基因的相对表达量.结果 20只接种NCI-H446细胞悬液的裸鼠中,1只裸鼠于操作过程中死亡,15只裸鼠成功成瘤,成瘤率为78.9％.肿瘤组织中WNT5A、WNT11基因的相对表达量明显高于癌旁组织(P﹤0.01);肿瘤组织中HSG基因的相对表达量明显低于癌旁组织(P﹤0.01).结论 HSG基因可能具有抑制小细胞肺癌成瘤的作用,WNT/Ca2+信号通路在NCI-H446细胞成瘤组织中大量开放并可能参与其成瘤过程.

目的:探讨同源重组修复途径关键调控蛋白SPIDR在小细胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC) 中的作用与机制.方法:收集2013年1月至2015年1月上海肺科医院进行肿瘤手术切除、气管镜穿刺的SCLC患者癌组织标本60例及正常人群肺组织标本44例, qRT-PCR检测临床组织样本SPIDR mRNA表达水平;经稳定过表达SPIDR改变NCI-H446细胞表达水平后, 采用MTT、小鼠荷瘤实验等实验方法, 在体内、体外探究SPIDR表达水平对SCLC细胞增殖等影响.结果:吸烟与患者SCLC的发生显著有关 (P<0.01);SPIDR m RNA在SCLC组织样本中的表达显著低于正常肺组织 (P<0.01) .人肺胚成纤维细胞株MRC-5中SPIDR mRNA和蛋白表达水平明显高于SCLC细胞株NCI-H446 (均P<0.05) .在10％胎牛血清常规培养体系中, 过表达SPIDR对NCI-H446细胞增值和化疗药物敏感性无明显影响 (均P>0.05), 但小鼠荷瘤实验从第9天开始, 过表达SPIDR组 (pMSCV-SPIDR) 的瘤体积与原始NCI-H446组和空载体组 (pMSCV) 开始出现明显差异, 第27天pMSCV-SPIDR组移植瘤平均体积分别比原始NCI-H446组与空载体组缩小58.99％和61.84％ (均P<0.01) .在含1％～3％胎牛血清的非常规培养体系中, 过表达SPIDR的NCI-H446细胞增殖速度显著低于原始NCI-H446组和空载体组 (P<0.05或P<0.01) .结论:SCLC组织中SPIDR表达水平明显低于正常肺组织, 过表达SPIDR的NCI-H446细胞体内及体外低血清含量培养 (<3％) 生长速度显著低于对照组, 表明SPIDR以低血清浓度依赖方式影响SCLC细胞增殖.