次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来.次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标.前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控.由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交 cDNA 文库,以HbHDA6 基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与 HbHDA6 相互作用的蛋白.结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为 6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为 1.54×107,文库重组率为 100%.初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为 1.1 kb和 1.2 kb.(2)成功构建了筛选 HbHDA6 互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6 诱饵载体,并确认无自激活活性.(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了 22 个与HbHDA6 发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6 等.该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索.

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是重要热带经济作物之一,其次生代谢产物天然橡胶(NR)是中国重要的工业原料及战略物资.植物激素对植物生长发育、萌发和环境应答等多方面均具有重要调控作用.本文详细介绍了乙烯、脱落酸、油菜素内酯和赤霉素4种植物激素在橡胶树生长发育、橡胶生物合成、产排胶和品质形成等关键环节中应用的研究进展,并展望4种激素在提高橡胶树产排胶机制研究中的应用前景,为支撑橡胶产业发展提供理论支撑.

CPP基因家族是广泛存在于动植物中,成员数目较少的一类转录因子家族,在植物生殖发育和细胞分裂过程中起着重要的调控作用.本研究以橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为供试材料,通过RT-PCR方法,在橡胶树花器官中克隆到一个CPP基因,命名为HbCPP1(登录号为MF360959).序列分析表明,HbCPP1基因开放阅读框为1 755bp,编码584个氨基酸,蛋白质分子量为63.676kDa,等电点(PI)为8.4.序列多重比对结果显示,Hb-CPP1蛋白具有CPP蛋白的特征基序,含有2个保守的CXC结构域和1个比较保守R结构域.进化树分析表明,HbCPP1属于A亚族基因,与其近缘物种木薯的MeCPP基因以及麻风树的JcCPP7基因同源性较高,进化关系较近.氨基酸组分、理化性质以及蛋白结构预测分析显示,HbCPPl蛋白是一个不具有跨膜结构和信号肽的不稳定亲水蛋白,可能定位于细胞核,其二级结构主要由两个蛋白结合区域和多个无规则的卷曲螺旋组成,其三级结构中CRC结构域构成了该蛋白的核心结构.利用QRT-PCR对HbCPP1基因在橡胶树不同组织中的表达量进行检测,分析结果表明HbCPP1基因在橡胶树茎尖、花序以及雌花中特异性高调表达.在干旱、盐、高温胁迫以及ABA处理下,HbCPP1基因的表达量呈显著下调表达;而在低温处理下,HbCPP1基因的表达量则呈显著上调表达,推测HbCPP1基因可能参与了橡胶树花器官发育以及对多种非生物学胁迫的响应过程.

小檗碱桥酶(BBE,EC1.5.3.9)是小檗碱生物合成中的关键酶.通过PCR扩增,克隆了橡胶树中HbBBE1基因.HbBBE1的启动子区域含有光、赤霉素、水杨酸、机械伤害、真菌诱导子、防御和应激反应元件.通过预测发现,HbBBE1蛋白质含有一个信号肽、一个跨膜区域、FAD结合结构域和特异性BBE结构域,它与木薯中的具有相同残基的BBE蛋白质具有80.1％的相似性.分析HbBBE1基因在橡胶树不同组织中的表达发现,其在乳胶中的表达量最高.白粉病侵染、干旱、高强度光照、过氧化氢、未割胶树割胶处理和机械伤害处理都能显着上调HbBBE1的表达.此外,外源激素赤霉酸、水杨酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和脱落酸处理也均可显著诱导HbBBE1的表达.在这些处理中,HbBBE1被赤霉酸刺激后表达量迅速升高,且在0.5h达到最大值(6.3倍).在脱落酸、乙烯利和过氧化氢等处理下,HbBBE1的表达显著;与未处理的对照相比,其表达倍数达数十倍.综上所述,我们的研究表明HbBBE1在响应橡胶树中的生物和非生物胁迫中起多种作用.

为了解巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)栽培种质的变异情况,以53份在云南植胶区综合性状表现较好的巴西橡胶树栽培种质为材料,采用流式细胞术测定了基因组C值,并进行了变异分析.结果表明,浅绿色嫩叶是巴西橡胶树流式细胞术测定的最适样品.53份巴西橡胶树栽培种质的细胞核DNA含量和基因组C值存在一定差异,基因组的平均C值是1.531696×109 bp,最小的是CRTG-272种质(1.465908×109 bp),最大的是CRTG-83种质(1.600381×109 bp),变异系数较小(CV=0.0355).53份巴西橡胶树栽培种质中有47份为二倍体,6份为三倍体.在已测定基因组大小的40种大戟科(Euphorbiaceae)植物中,基因组大小变异较大(CV=1.2486),与"C值悖论"观点相一致.因此,应用流式细胞术能快速、准确地测定巴西橡胶树细胞核DNA含量、基因组C值和染色体倍性.

为了筛选巴西橡胶体胚植株最为适合的植物凝胶和蔗糖用量,该研究以巴西橡胶树无性系热研7-33-97成熟体细胞双子叶次生胚状体为材料,以添加0.23μmol·L-1 KT,0.11μmol·L-1 IAA和8.7μmol·L-1 GA3的MS培养基为植株再生培养基,研究了添加不同用量的植物凝胶和蔗糖对巴西橡胶树体胚植株再生和生长的影响.结果表明:在橡胶树体细胞胚植株再生培养基中,不同用量的植物凝胶对植株再生频率和植株生长状况有显著影响,较低浓度(0～1 g·L-1)时,随着用量增加,植株再生频率提高,但较高浓度(1～4 g·L-1)时,随着用量增加,植株生长受到抑制.植物凝胶添加1 g·L-1时植株生长最好,植株再生率为(86.4±5.7)％,株高5 cm以上的占(53±9.4)％,带叶植株为(81.7±3)％;而蔗糖对植株再生频率影响不显著,但对再生植株生长的影响显著,低蔗糖(20～30 g·L-1)时促进植株抽叶但抑制茎干伸长,高蔗糖(70～80 g·L-1)时显著抑制抽叶但促进茎干伸长.蔗糖添加50 g·L-1时植株生长最好,株高5 cm以上的占(57.6±5.4)％,株高5 cm以上带叶植株占(46.3±12.3)％,均为最高且从外观来看,在50 g·L-1时植株茎干和根都较为粗壮.因此,在橡胶树体细胞胚植株再生培养基中,植物凝胶和蔗糖最佳用量分别为1 g·L-1和50 g·L-1.

橡胶延长因子REF、小橡胶粒子蛋白SRPP、橡胶转移酶HRT1和HRT2是巴西橡胶树胶乳中的主要橡胶粒子蛋白, 它们在橡胶生物合成中发挥重要作用, 与橡胶树胶乳产量密切相关.为进一步探明REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达与橡胶树胶乳产量之间的关系, 以成龄未开割橡胶树无性系热研7-33-97胶乳为材料, 通过实时荧光定量PCR的方法, 对割胶伤害、外源乙烯利和茉莉酸刺激的处理条件下, 橡胶树胶乳中的REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达进行了分析.结果表明, 随着割胶刀次的增加, REF基因在第4刀的表达量最高, 而SRPP、HRT1和HRT2基因则在第6刀表达量达到最高;而在乙烯利和茉莉酸刺激处理下, REF、SRPP、HRT1和HRT2基因均在刺激8 h后表达量达到最高.因此, 割胶 (机械伤害) 、外源乙烯利和茉莉酸刺激促进橡胶树产胶可能与它们提高橡胶生物合成相关橡胶粒子蛋白REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达具有密切关系.

bZIP转录因子普遍存在于真核生物中, 参于多种生物学过程.为分析橡胶树bZIP转录因子的结构功能, 本研究克隆了1个bZIP基因家族成员, 命名为HbbZIP40 (登录号:KY807075).该基因属于bZIP转录因子基因家族A亚族, 全长1 110 bp, 包含一个长为900 bp的完整开放读码框, 含bZIP结构域, 是bZIP基因家族成员.q RT-PCR技术检测分析发现, HbbZIP40在草甘膦和干旱处理下显著上调表达, 推测HbbZIP40与橡胶树干旱、草甘膦药害胁迫相关.研究橡胶树bZIP转录因子, 对弄清其在橡胶树抗逆机制中的作用与机制具有重要意义.

HbWRKY是橡胶树中的一类转录因子基因家族,该家族基因编码的蛋白质参与橡胶树的产胶、衰老和抗逆胁迫等生理生化过程,植物激素类物质刺激(如乙烯利、茉莉酸、水杨酸等)、病原菌侵染和机械伤害均能诱导HbWRKYs基因的表达.目前,该基因家族的大部分基因已被克隆和分析,但这些基因在染色体上的具体位置尚未确定.本研究以巴西橡胶树热研7-33-97品系为材料,利用荧光原位杂交技术(FISH)和原位PCR技术对Hb WRKYs基因家族中10个成员(HbWRKY1、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4、HbWRKY5、HbWRKY7、HbWRKY9、HbWRKY11、HbWRKY27和HbWRKY7)进行了物理定位分析.结果表明:HbWRKY1、HbWRKY4和HbWRKY5基因同时定位在第9号染色体上,其中HbWRKY1和HbWRKY4在第9号染色体短臂上,其信号位点距离着丝粒的平均百分距分别为57.38和4.57,Hb WRKY5在第9号染色体长臂上,其信号位点距离着丝粒的平均百分距为31.67;HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY7、HbWRKY9、HbWRKY11和HbWRKY75基因分别定位在第8、3、4、10、2和7号染色体的短臂上,信号位点距离着丝粒的平均百分距分别为6.00、12.30、4.40、45.21、5.74和26.11;HbWRKY27基因定位在第6号染色体长臂上,其信号位点距离着丝粒的平均百分距为38.88.本研究还讨论了这些基因与其他已定位基因之间的位置关系.

活性氧是一类含氧的化学活性小分子,会对细胞的结构和功能产生危害.抗坏血酸过氧化物酶(APX)是活性氧清除系统的关键成员之一,对于维持植物体内活性氧代谢平衡有着重要作用.通过生物信息学方法,本研究从橡胶树全基因组序列中鉴定出8个HbA PXs.进化树分析显示这些成员可归为2个亚类;基因结构结果显示每个成员至少含有4个内含子;转录组数据分析表明HbA PXs在橡胶树不同组织、叶片不同发育时期及乙烯利处理后不同阶段胶乳中的表达存在差异,其中HbA PX3和HbA PX8可能在叶片发育和胶乳活性氧代谢调控中起关键作用.橡胶树HbA PXs的鉴定为深入探索橡胶树生长发育及响应外界胁迫中的分子机制提供一定基础.