目的 通过生物信息学分析寻找布鲁氏杆菌性脊柱炎(BS)患者椎间组织中差异表达基因(DEGs)和关键信号通路,为深入了解BS的免疫相关机制及寻找新的治疗靶点提供理论依据.方法 收集4例BS患者和3例腰椎间盘突出(LDH)患者术中的椎间组织完成转录组测序.通过生物信息学分析找到BS患者和LDH患者椎间组织的DEGs,使用Enirchr在线富集工具对筛查到差异表达的免疫基因进行基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,用Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并筛选识别关键基因.收集14例BS患者(BS组)和10例LDH疾病患者(Control组)的椎间组织进行qRT-PCR验证生物信息学分析结果,同时收集患者外周血,使用流式细胞术检测两组患者外周血中M2型巨噬细胞及Th2细胞的比例.结果 BS患者病灶处椎间组织中M2型巨噬细胞与Th2细胞比例均较LDH患者升高(P＜0.05).筛选出的DEGs共1 651个,上调基因1 294个,下调基因357个.对1 651个DEGs进行GO功能富集分析,其生物学过程主要集中于抗原处理和呈递、免疫反应、免疫系统过程等;细胞组分主要富集在MHC蛋白复合体、MHC Ⅱ类蛋白复合物、细胞膜的重要组成部分中,分子功能主要与磷酸酶活性、多糖结合、离子通道活性有关.KEGG通路富集分析显示,PI3K-Akt信号通路、钙信号通路和MAPK信号通路等与BS发展密切相关.通过PPI网络分析筛选出前20的关键基因与PI3K-Akt信号通路的基因取交集后获得3个关键基因,分别为:FN1、EGFR、EGF.qRT-PCR结果显示,BS组患者病灶处椎间组织FN1、EGFR、EGF的mR-NA表达均高于Control组(P＜0.000 1).结论 FN1、EGFR、EGF可能是预测BS的生物学标志物及潜在治疗新靶点,本研究有助于加强对BS相关免疫调节机制的了解.

目的 探究布鲁氏菌104M疫苗株A抗原的主要成分,从A抗原中筛选潜在候选蛋白,为布鲁氏菌新型疫苗的研制提供基础.方法 本研究利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝染色、鲎试剂检测脂多糖、脂多糖银染对布鲁氏菌104M疫苗株A抗原的主要成分进行解析,通过与免疫绵羊血清的蛋白免疫印记实验,选取有印迹的部分切胶酶解,利用液相色谱-串联质谱对这部分蛋白进一步解析,通过抗原分析工具VaxiJen和毒力蛋白分析工具VirulentPred,筛选布鲁氏菌A抗原评分0.6以上的毒力相关蛋白作为潜在的候选疫苗.结果 布鲁氏菌A抗原是一种淡黄色棉花糖状、质量较轻的物质,主要由蛋白和脂多糖构成,对A抗原的蛋白质组鉴定显示,104M A抗原共有1 142种蛋白,能够与绵羊血清反应的蛋白有172种,VaxiJen抗原性评分在0.6以上的有87种蛋白,其中毒力相关蛋白有38种.结论 布鲁氏菌104M疫苗株A抗原的主要成分是蛋白质和脂多糖,对筛选到的A抗原中的候选蛋白需要进一步的实验来测试这些蛋白质的免疫原性和保护水平以设计出针对布鲁氏菌病更为有效和安全的疫苗.

[目的]布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,是由布鲁氏菌引起的以感染家畜为主的人畜共患传染病,造成严重的公共卫生问题.目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合,所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要.本文建立布鲁氏菌病荧光偏振(FPA)抗体检测方法,为布鲁氏菌病(布病)的快速高效诊断提供技术手段.[方法]提纯猪种布鲁氏菌S2株脂多糖O链(OPS),经异硫氰酸荧光素(FITC)标记后作为诊断抗原.通过对样品稀释液、抗原稀释度、反应时间等条件的优化,初步建立了布鲁氏菌荧光偏振诊断方法.用该方法对148份布病阳性血清(其中牛血清70份,羊血清78份)和155份布病阴性血清(其中牛血清82份,羊血清73份)进行检测,确定其敏感性和特异性.按确定的技术参数,制备3批布鲁氏菌FPA抗体检测试剂盒,使用质控阴、阳性血清分别评价试剂盒的批内和批间重复性.用400份临床样本比较本研究开发试剂盒与商品化进口FPA试剂盒的符合率.[结果]使用0.5％蔗糖磷酸缓冲液作为血清样品稀释液;标记抗原的使用浓度为90 μg/mL;最佳反应时间为3-5 min.本检测方法的判定标准为:δmP值＜20时为阴性,δmP值≥20时为阳性.按上述条件建立的FPA检测148份布病阳性血清和155份布病阴性血清,结果敏感性为98.6％,特异性为98.7％.对400份临床样本的比对检测显示,研究建立的FPA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为94.0％.[结论]研究建立的布鲁氏菌PFA抗体检测方法具有良好的特异性和敏感性,可作为一种重要的布病诊断快速诊断方法.

目的:研究OMP31表位的抗原性和免疫应答特点,为布鲁氏菌表位疫苗的研制奠定基础.方法:利用生物信息软件筛选OMP31 T-B联合优势抗原表位,进一步合成肽段.用OMP31肽段免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平,ELISPOT检测脾淋巴细胞中IFN-γ阳性的T淋巴细胞活化情况.结果:用OMP31合成肽段免疫BALB/c小鼠4次后,小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平升高,小鼠脾淋巴细胞集落形成单元(SFU)增高.结论:OMP31 T-B联合表位抗原能增强小鼠Th1免疫应答和体液免疫应答,可以作为布鲁氏菌病的候选疫苗.

目的 为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法.方法 本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测.结果 纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性.以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测.结论 研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测.

目的 构建和原核表达布鲁氏菌膜蛋白Omp2a,并进行抗原性鉴定. 方法 将布鲁氏菌外膜蛋白Omp2a基因连接到pET-30α原核表达载体上,转化到大肠埃希菌菌株BL21内.重组蛋白rOmp2a经IPTG诱导,亲和层析纯化后用SDS-PAGE凝胶电泳分离,确定目的蛋白的大小和表达丰度.通过Western blot与患者血清反应,确定重组rOmp2a的抗原性及诊断价值. 结果 成功构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp2a的原核表达系统,测序表明阅读框架正确.用IPTG可诱导高表达Omp2a,SDS-PAGE显示其分子质量单位为38.4 ku,且其表达蛋白以包含体形式存在.Western blot显示rOmp2a能被布鲁氏菌感染患者血清识别,而不与细粒棘球绦虫和单纯疱疹病毒感染者血清反应.结论 大肠埃希菌原核表达系统可高效表达不可溶的rOmp2a蛋白,该蛋白具有反应原性,对布鲁氏菌感染患者具有潜在的诊断价值.

目的 采用生物信息学方法预测和分析布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的理化性质、信号肽、蛋白结构和抗原表位,为布鲁斯病基因疫苗的研制提供理论基础. 方法 从GenBank中获取Omp31的氨基酸序列,运用在线软件Protparam分析Omp31的理化性质;采用SOPMA软件预测和分析布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的二级结构. 结果 利用在线软件预测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31分子式为C1135H1725N297O354S4,脂溶性指数为87.31,蛋白质的疏水值为63.26,理论pI值为8.61,原子总数为47 900;其氨基酸序列Gly(G)占12.9％,Ala(A)占11.7％.正电荷残基(Arg+ Lys)、负电荷残基(Asp+ Glu)总数分别为19和24,其不稳定系数48.25.该蛋白为稳定蛋白,亲水性系数GRAVY为-0.091.Omp31无跨膜区域,属于水溶性蛋白,其中无规则卷曲较多,位于蛋白表面.蛋白质中大部分氨基酸可以形成一定的结构域,抗原性总预测值为0.632 4. 结论 生物信息学分析鲁氏菌外膜蛋白Omp31含有多个抗原表位,可能具有免疫原性,表明该蛋白可作为潜在抗原用于疫苗的研制.

本文报告了我国首次用犬种布鲁氏菌RM66/6株制备几种诊断犬种菌布病的抗原：试管凝集抗原、虎红平板凝集抗原、CFT抗原，还包括制备兔抗犬血清球蛋白。用这些制剂检查有限数量的犬血清均获得了满意的结果。为在我国开展犬种布病的流行病学调查和诊断病人提供了可靠的手段。

已报道由104-M活菌苗中提取的化学组分A及E在实验动物中引起的保护作用与活菌苗相似，但不形成明显的血清特异性抗体及皮肤变态反应。为此，本实验采用豚鼠腹腔细胞在体外作吞噬试验；利用小鼠腹腔细胞在体内进行吞噬以及血清杀菌力、转输血清及细胞后进行被动保护力等试验，探讨了化学组分的免疫机制，并同104M活菌苗进行了对比。结果表明E化学组分免疫后迅速激活机体的免疫系统，使细胞及血清制菌活性升高，并具有被动保护功能，腹腔细胞优于脾细胞。与活苗组动物比较，接种E组分后导致的细胞免疫持续时间短，血清的保护作用持续时间长。

首次应用布鲁氏菌抗原致敏的免疫胶乳，分别对46例布鲁氏菌病患者及52头布鲁氏菌感染乳牛的血清进行了检查，其阳性率分别为60.87%和90.38%。本试验与其他5种血清学试验的比较结果表明，它与试管凝集试验的符合率最高可达100%，是一种特异、敏感、快速和简便的血清学试验，尤适宜于基层应用。