黄草乌为云南的道地药材,其富含滇乌碱等二萜生物碱,二萜生物碱是其主要活性成分.法呢基焦磷酸合酶(FPS)是萜类生物合成途径中的一个关键酶,在二萜生物碱生物合成中发挥重要作用,其功能研究有助于揭示二萜生物碱合成的分子机制.该研究基于黄草乌转录组数据,筛选到 1 条FPS基因(AvFPS),克隆其全长序列并进行了生物信息学分析、功能验证以及基因表达分析.AvFPS开放阅读框(ORF)为 1 056 bp,编码 351 个氨基酸,相对分子质量约为 41 kDa,其具有异戊烯基转移酶的 2 个典型保守功能域"DDIMD"和"DDYXD".在大肠杆菌中表达AvFPS重组蛋白,用纯化重组蛋白进行体外酶促反应,结果表明,AvFPS能够催化法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)的合成.qRT-PCR分析结果表明,AvFPS基因在黄草乌根、茎、叶和花中均有表达,在根中表达量最高;经MeJA诱导后,AvFPS的表达量明显上调.该研究明确了AvFPS的催化功能,揭示了AvFPS在不同组织以及经MeJA诱导不同时间段的表达模式,为更深入了解FPS基因在二萜类成分生物合成途径中的功能提供了参考.

[目的]异戊烯基转移酶(isopentenyl transferases,IPT)参与反式玉米素(trans-zeatin,tZ)的生物合成.tZ是调节植物生长发育和抵抗逆境胁迫的一种细胞分裂素类型,在促进芽生长和调控植物侧枝发育方面具有重要作用.探索IPT的功能,为后续新麦草产量性状改良提供了理论依据.[方法]通过对新麦草IPT进行系统发育和多序列比对,探究其编码氨基酸序列的特征和同源性.通过花粉管通道法获得过表达PjIPT拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,并运用逆转录PCR(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot,WB)对转基因植株进行验证,利用实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)对其组织表达模式进行分析,使用液质联用系统测定反式玉米素.[结果]IPT在新麦草(Psathyrostachys juncea)和二粒小麦(Triticum dicoccoides)等麦类作物中具有高度同源性,且AtIPT9 是PjIPT的同源蛋白.通过花粉管通道法获得过表达PjIPT拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,证明PjIPT上调植株分枝数.RT-PCR和蛋白质印迹分析显示,PjIPT在转录水平和蛋白水平均能够正常表达.利用不同部位组织RT-qPCR分析PjIPT的空间特异性表达,结果显示,PjIPT在拟南芥的分蘖节和叶中特异性表达.此外,反式玉米素的定量分析表明PjIPT通过参与tZ的生物合成去调控拟南芥植株分枝数.[结论]PjIPT是上调植株分枝数的关键基因.

香豆素是一类以苯骈α-吡喃环为母核的天然产物,许多香豆素衍生物具有多种药理活性,如抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抗骨质疏松、杀虫等,在医药、农业领域发挥了重要作用.香豆素衍生物的开发利用一直备受关注.随着基因测序技术的成熟以及合成生物学的快速发展,香豆素衍生物的生物合成研究已取得许多重要进展,也日益受到国内外学者的关注.该文综述了目前已报道的香豆素衍生物的生物合成关键酶,如细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzyme,CYP450)、异戊烯基转移酶(prenyltransferase,PT)、UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)等,并对其在抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等方面的药理活性进行系统总结,期望为香豆素衍生物的生物合成研究及其药用潜力的进一步挖掘提供参考价值.

目的:探究北沙参中香豆素含量及IPT基因相对表达量的差异,为北沙参品质评定及进一步选优育种提供理论依据.方法:采用HPLC法测定北沙参中 9 个香豆素的含量,实时荧光定量PCR检测异戊烯基转移酶基因(IPT)的相对表达量.结果:栽培品种北沙参莱阳、赤峰及野生品种八仙岛、金石滩、海阳中香豆素含量较高;赤峰和海阳种源中北沙参IPT基因相对表达量较高;IPT基因表达量与补骨脂素、异茴芹内酯含量呈极显著正相关(P<0.01);主成分分析得出莱阳与海阳为优质北沙参种源.结论:该实验探究了8 个种源北沙参中香豆素的含量、IPT基因表达量的差异及二者间的相关性,可为筛选具有高应用价值的北沙参种源提供参考,有助于北沙参的进一步开发利用.

生姜是一种重要的"药食同源"植物,但其种植过程中容易受到各种生物/非生物胁迫的影响,不利于生姜的安全生产.异戊烯基转移酶(IPT,isopentenyl-transferases)是催化细胞分裂素生物合成的关键酶,也是重要的限速酶,与植物的抗逆性关系密切.本研究通过系统的生物信息学分析,从生姜基因组中鉴定到10个ZoIPT,并且将其命名为ZoIPT1～ZoIPT10.其编码蛋白的氨基酸长度范围在283～491 aa之间,分子质量在31.14～54.02 kDa,等电点在4.97～9.37之间;蛋白质特征分析表明,所有ZoIPTs均具亲水性.共线性关系分析发现生姜IPT基因与15个芭蕉IPT基因存在共线性,与1个拟南芥IPT基因存在共线性.转录组数据分析结果显示,ZoIPTs有一定的组织表达特异性,并且能响应病害、低温等逆境胁迫,其中,ZoIPT3和ZoIPT5在生姜不同生长时期、不同部位、低温和病害胁迫下均有较高表达.qRT-PCR分析结果表明,ZoIPTs响应干旱、淹水、盐胁迫.在淹水和盐胁迫下,根茎中ZoIPT3表达量显著上升;在干旱胁迫下,叶和根茎中ZoIPT5的表达显著上升.综上所述,本研究通过系统的鉴定、进化分析、特征分析、启动子分析、表达模式分析,并对干旱、盐、淹水胁迫下的表达模式进行了分析,为深入研究ZoIPT在调控生姜生长发育和抗逆性中的生物学功能提供了理论基础.

类异戊二烯(isoprenoids)是最具化学多样性的一种天然分子家族,参与微生物中类胡萝卜素、甾醇等次生代谢物的合成,这类物质在工业大规模生产中具有广阔的商业前景.异戊烯基转移酶是类异戊二烯合成途径中的关键酶,其活性及编码基因的转录水平参与调节次生代谢物产量,在类异戊二烯化合物生物合成途径中发挥重要作用.本文重点归纳了微生物中异戊烯基转移酶的发现与鉴定,分析其结构特点与链长决定机制,讨论异戊烯基转移酶家族之间的复杂进化,概述酶基因表达调控的应用以及生物合成研究现状,为深入研究异戊烯基转移酶作用机理及各领域中的应用提供思路.

异戊烯基取代的酚类化合物由UbiA家族的异戊烯基转移酶(prenyltransferase)催化异戊烯基转移到芳香族化合物母核上,其亲脂性较无异戊烯基取代的化合物明显增强,并提高了与生物膜的亲和力,从而形成了各种具有重要生物学功能的活性分子,在植物防御和人体健康方面具有重要作用.本综述总结了 538种异戊烯基酚类化合物的取代基类别和取代位点等,为发掘植物中新型异戊烯基转移酶,以及受体和供体的选择提供参考,以期有更多异戊烯基转移酶可应用于合成生物学来生产具有重要活性的异戊烯基酚类化合物.该文对国内外报道的378种类黄酮,80种香豆素类,27种醌类,32种二苯乙烯类,16种对羟基苯甲酸类,5种苯丙酸类共计538种异戊烯基取代的酚类化合物的取代基类别、取代位置以及在植物中的分布进行总结,发现异戊烯基酚类化合物主要分布在28个科中,且以C5和C10取代基为主.该文还综述了已鉴定功能的30余种植物芳香族异戊烯基转移酶.

目的 研究小槐花Desmodium caudatum抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用,并探讨其对Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的调控作用.方法 采用不同条件制备8种小槐花提取物,MTT法检测小槐花提取物1～8对HCT-116、SW480细胞增殖的影响;结晶紫染色检测小槐花提取物2、3对结肠癌HCT-116、SW480细胞集落形成的影响;划痕实验检测小槐花提取物2、3对HCT-116、SW480细胞迁移的影响;从活性较高的提取物2中提取分离出5个黄酮类化合物(1～5),MTT法检测化合物1～5对HCT-116、SW480、HepG2、RAW264.7、LX-2细胞增殖的影响;结晶紫染色检测化合物1(8-异戊烯基槲皮素,0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μmo1·L-1)对HCT-116和SW480细胞集落形成的影响,划痕实验检测8-异戊烯基槲皮素对HCT-116和SW480细胞转移的影响.Western blotting实验检测8-异戊烯基槲皮素对HCT-116和SW480细胞中AMPK和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响;荧光素酶报告基因检测实验观察8-异戊烯基槲皮素对β-catenin与T细胞因子(TCF)结合能力的影响.结果 与对照组比较,小槐花根茎提取物2和3以及8-异戊烯基槲皮素能显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移(P＜0.05、0.01、0.001).与对照组比较,8-异戊烯基槲皮素能够显著上调p-AMPK蛋白的表达(P＜0.05、0.001),显著下调AMPK、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT-1A)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白的表达(P＜0.05、0.01、0.001),表明其能够促进癌细胞AMPK信号通路的激活.与对照组比较,8-异戊烯基槲皮素显著下调β-catenin以及其下游糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、核内原癌基因(c-Myc)和G1/S-特异性周期蛋白-D1(CyclinD1)的蛋白表达(P＜0.05、0.01、0.001),同时显著降低TCF报告基因结合位点(野生型)和荧光素酶开放阅读框TOPflash(pGL3-OT)活性(P＜0.05、0.01),但不影响FOPflash(含突变位点)活性,表明其抑制β-catenin的表达和β-catenin/TCF复合物的结合.结论 小槐花黄酮8-异戊烯基槲皮素通过调控Wnt/β-catenin和AMPK信号通路抑制结肠癌细胞增殖和转移.

对异戊烯基转移酶NovQ在毕赤酵母Gpn12异源表达过程中诱导剂甲醇添加量进行了探究,并以毕赤酵母Gpn12全细胞为酶源,以甲萘醌、异戊烯醇为前体,催化合成维生素K2 (MK-3).每24 h添加2％甲醇时,NovQ表达量提高约36％.考察摇瓶中初始pH、温度、甲醇添加量、前体(甲萘醌、异戊烯醇)添加量、催化时间、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)添加量等7个因素对Gpn12全细胞催化合成MK-3的影响,发现催化温度、甲萘醌添加量、催化时间影响显著,对3个显著因素进行响应面优化得出催化条件为:催化温度31.56℃,甲萘醌添加量295.54 mg/L,催化时间15.87 h,优化后的摇瓶MK-3产量达到98.47 mg/L,与响应面预测结果一致,较优化前对照组提高了35％.在30 L发酵罐进行生物催化实验,催化时间24 h,细胞催化剂浓度220 g(干重)/L,MK-3产量达到189.67mg/L.该方法为Gpn12规模化生产MK-3奠定了一定的基础.

C-糖基化和C-异戊烯化是两个重要的C-C键形成反应,可用于具有药理活性天然/非天然产物的制备,多样化及结构修饰.本研究中,我们将具有杂泛性的C-糖基转移酶MiCGT和异戊烯基转移酶AtaPT偶联,一锅法对酰基间苯二酚类化合物分步进行C-糖基化/异戊烯基化修饰.通过MS和NMR数据分析及文献对比,我们获得了5个新的bis-C-烷基化产物.本研究通过偶联两步酶促bis-C-烷基化反应,为结构新颖及多样化且同时含有C-糖基和C-异戊烯基类化合物的合成提供了一种潜在策略.