目的 探讨白细胞介素33(IL-33)介导M2巨噬细胞在口腔黏膜上皮-间充质转化(EMT)中的相关作用机制.方法 将25只雄性BALB/c小鼠分为口腔黏膜成纤维化(OSF)组(20只)和对照组(5只).OSF组通过槟榔碱刺激建立OSF小鼠模型,对照组使用PBS注射液在相同部位给药.观察口腔黏膜组织巨噬细胞表型、IL-33以及转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad通路表达水平;培养人口腔黏膜细胞并与M2巨噬细胞相互作用体外模型,使用IL-33添加剂和TGF-β受体抑制剂,观察EMT标志物表达水平.结果 HE染色和Masson染色证实了口腔黏膜纤维化模型建立成功,与对照组比较,OSF组口腔黏膜组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平降低,波形蛋白(Vimentin)表达水平升高(均P＜0.05).此外,观察到IL-33和TGF-β水平升高以及TGF-β1/Smad通路激活,巨噬细胞在口腔黏膜组织中聚集且表型为M2巨噬细胞.与空白对照组比较,IL-33组E-cadherin水平降低,Vimentin的表达增高(均P＜0.05);LY-2109761+IL-33 组与 IL-33 组相比,E-cadherin 的表达增高,Vimentin 的水平降低(均 P＜0.05).Western blot 检测TGF-β、p-Smad2和Smad2的表达水平提示,与IL-33组相比,LY2109761+IL-33组IL-33对TGF-β有促进作用(P＜0.05);IL-33组与空白对照组相比,p-Smad2水平显著提高(P＜0.05);LY-2109761+IL-33组与IL-33组相比,p-Smad2水平显著降低(P＜0.05).结论 IL-33通过介导M2巨噬细胞调控TGF-β1/Smad通路促进口腔黏膜上皮间质转化.

目的 探究槟榔的成分及其促进口腔黏膜下纤维化的机制.方法 采用Thermo QE plus液相色谱串联高分辨质谱仪和Compound discover 3.2数据处理软件进行槟榔中药化学成分分析,将检测到的化合物以质谱响应值排序,分析排名前20化合物的活性.化合物活性来源根据《中国药典(2015版)》汇总,数据查询基于PubChem、Chemical book以及Scifinder数据库.借助网络药理学方法分析槟榔影响口腔黏膜下纤维化(OSF)的潜在活性成分、核心靶点及主要影响的生物功能、信号通路.通过整合人类基因数据库(Genecards)、基因组百科全书数据库(KEGG)等数据库获取OSF的作用靶点.以OB≥30%为条件,在中药系统药理学技术平台(TCMSP)中筛选出槟榔可作用于靶点的化合物,并构建靶点-化合物、化合物-中药、靶点-化合物-中药网络.运用MOE软件的分子对接技术,分析成分-靶点结合的可能性,再利用Pymol软件进行分子对接可视化.最后通过免疫组化在临床样本中验证槟榔是否影响PI3K-Akt、MAPK两条通路涉及的主要蛋白,初步验证槟榔诱导OSF的潜在作用机制.结果 基于网络药理学和槟榔粗提物中筛选出前10的化合物与OSF核心靶点中核心交集基因,确定了槟榔可能通过调控PI3K-Akt与MAPK通路.通过免疫组化在临床样本中验证,细胞膜上的PI3K蛋白表达量在OSF患者组中表达下降(P=0.0002),p-PI3K(P=0.0002)表达量上升,进一步激活下游的AKT1蛋白表达增加(P=0.0006),加剧磷酸化蛋白p-AKT蛋白的表达及堆积(P=0.0013);而在MAPK通路中,OSF患者组对比正常组,通过上调JNK蛋白(P=0.0130),诱导下游AP-1复合蛋白c-jun及c-fos转录因子的活性增加,促使其向细胞核聚集;且OSF患者组较正常组血浆的IL-6(P<0.0001)与IL-8(P=0.0095)含量均上升.结论 槟榔碱、槟榔次碱、异去甲槟榔碱等槟榔中的主要活性成分可能通过刺激PI3K-Akt与MAPK信号通路,促进炎症介质IL-6及IL-8的表达,诱导胶原增生,导致口腔黏膜下纤维化病变.

目的:探讨三七总皂苷(PNS)在槟榔碱(ANE)诱导的口腔黏膜下纤维化中的抗纤维化作用,并分析PNS对核因子E2相关因子2(Nrf2)/谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)信号通路的影响.方法:采用CCK-8法评估不同浓度的PNS和ANE对人永生化角质形成细胞系HaCaT活力的影响,根据CCK-8结果选择75 mg/L的ANE及25、50和100 mg/L的PNS作为后续实验浓度;细胞设为空白对照组、模型组和PNS低、中、高剂量(25、50和100 mg/L)组,采用Western blot和RT-qPCR法检测各组细胞中I型胶原(COL-I)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Nrf2、GCLC和谷胱甘肽还原酶(GR)的蛋白及mRNA表达情况;采用免疫荧光法检测Nrf2入核情况;采用生化试剂盒检测各组细胞中谷胱甘肽(GSH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)含量.结果:与空白对照组相比,模型组细胞中COL-I蛋白及mRNA表达上调,E-cadherin、Nrf2、GCLC、核Nrf2和GR的蛋白及mRNA表达下调,细胞中NADPH、MDA和ROS含量升高,GSH含量和SOD活性明显减弱;与模型组相比,PNS 50和100 mg/L组细胞中COL-I蛋白及mRNA表达下调,E-cadherin、Nrf2、GCLC、核Nrf2和GR的蛋白及mRNA表达上调,细胞中NADPH、MDA和ROS含量下降,GSH含量和SOD活性明显增强(P<0.05,P<0.01).结论:PNS具有抗HaCaT细胞纤维化作用,其作用机制可能与激活Nrf2/GCLC信号通路,进而抗氧化应激改善口腔黏膜下纤维化有关.

目的 评价抗寄生虫中药水提物和有机溶剂粗提物体外对细粒棘球蚴的作用效果.方法 从感染绵羊肝脏细粒棘球蚴包囊中分离原头节,体外培养24h后,取活性大于95％的原头节(100 μl,约100个)加入96孔板,分别加入终浓度为0.8 mg/ml(低浓度组)、1.6 mg/ml(中浓度组)、3.2 mg/ml(高浓度组)的鸦胆子、苦楝皮、辣蓼、石榴皮、使君子、槟榔、贯众、鱼藤、马蔺子、五倍子和仙鹤草等11种抗寄生虫中药的水提物,体外作用72 h后,伊红染色法检测原头节活性,倒置显微镜观察下观察原头节的形态,计算死亡率;同时设相同浓度的阿苯达唑组和空白对照组.从具有体外抗原头节作用的中药中提取黄酮、多糖、皂苷和生物碱等粗提物,分别以终浓度1.00 mg/ml体外作用于原头节72 h后,观察原头节形态,计算死亡率;同时设空白对照组.对体外抗原头节效果明显的粗提物进行液相色谱与串联质谱联用分析.组间比较采用单因素ANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 中药水提物作用72h后,鸦胆子、苦楝皮、辣蓼水提物高浓度组原头节边缘模糊,结构松散,基质溶解;其余8种中药水提物高浓度组原头节形态正常,各部分结构清晰;阿苯达唑组原头节生发层有轻微损伤;空白对照组原头节形态正常.体外培养72 h后,鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物高浓度组原头节的死亡率分别为(99.63±0.57)％、(90.89±1.10)％和(51.93±0.60)％,中浓度组分别为(85.97±1.50)％、(81.14±1.19)％、(42.46±0.56)％,低浓度组分别为(78.34±1.35)％、(77.27±0.92)％、(36.66±0.60)％,与空白对照组[(0.62±0.51)％]相比差异均有统计学意义(F=180 678.22、41 488.99、44 346.38,19 543.86、27 887.32、34 590.79,20 059.467、41 953.68、17 993.77,均 P＜0.01),与阿苯达唑组[(30.03±2.02)％]比较差异均有统计学意义(F=6 585.72、4 210.84、646.46,2 956.80、2 849.68、210.83,2 365.92、2 712.28、58.12,均 P＜0.01);其余8种中药水提物高、中、低浓度组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷、辣蓼皂苷和辣蓼生物碱组原头节皱缩、结构松散、基质溶解,原头节死亡率分别为(98.33±2.89)％、(96.67±5.77)％、100％、(99.33±1.15)％和(56.67±2.11)％,与空白对照组[(10.33±2.51)％]比较差异均有统计学意义(F=1 584.00、563.71、3 808.47、3 099.52、14.65,均P＜0.01);其余中药粗提物组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).液相色谱与串联质谱联用分析结果显示,正、负离子模式下分别鉴定出741、398种代谢产物,其中正离子模式下从鸦胆子黄酮粗提物中鉴定出差异显著的黄酮类化合物4种,分别为漆黄素、5-甲基-7-甲氧基异黄酮、儿茶素和甜橙黄酮;负离子模式下鉴定出8种,分别为原花青素B2、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、枸桔苷、橙皮素、槲皮素、木犀草素、芹菜素和黄豆黄素.结论 鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物,鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷和辣蓼皂苷有明显体外抗细粒棘球蚴的作用,且效果优于阿苯达唑.

目的 建立经典名方达原饮基准样品的HPLC特征图谱,并对其关键质量属性量值传递进行研究.方法 按照古代工艺制备15批达原饮基准样品,建立其特征图谱,明确其特征峰并对其进行特征峰归属分析;对达原饮基准样品进行多成分含量测定,分析主要成分从饮片到基准样品的传递规律.结果 15批达原饮基准样品的特征图谱相似度均大于0.97,特征图谱相似度良好,共指认20个共有峰,其中4号峰来自槟榔,3、11、19、20号峰来自厚朴,12～16、18号峰来自黄芩,1、7、8、10号峰来自白芍,2、6号峰来自知母,5、17号峰来自甘草,9号峰为厚朴和白芍共有;全处方干膏率范围和平均转移率为12.88％～16.42％和72.41％.各指标成分的含量范围及饮片到基准样品的平均转移率分别为槟榔碱0.08％～0.19％和17.48％,厚朴酚与和厚朴酚0.0215％～0.052 2％和15.85％,黄芩苷22.12％～28.72％和59.36％,芍药苷0.84％～1.32％和38.88％,芒果苷0.08％～0.13％和21.58％,甘草酸铵0.15％～0.25％和10.39％.结论 特征图谱结合出膏率和多指标成分含量测定对达原饮基准样品的量值传递规律进行研究,为达原饮的质量控制和制剂开发提供了科学依据.

目的 探讨槟榔碱对脂多糖(LPS)诱导小鼠小胶质细胞BV2 炎症反应的改善作用及机制.方法 取对数生长期的BV2 细胞分为空白组和LPS(0.01、0.1、1、10、20 μg/mL)组,CCK-8 法检测细胞活力,分光光度法检测一氧化氮(NO)含量.另取细胞分为空白组、模型组、槟榔碱(10、20、40 μmol/L)组.CCK-8 法检测细胞活力;分光光度法检测NO含量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素 6(IL-6)、白细胞介素 1β(IL-1β)和抗炎因子白细胞介素 10(IL-10)水平;实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞中TNF-α、IL-6、IL-1 β、一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达表达;Western blotting法检测Toll样受体4(TLR4)、p-p65、p65、环氧化酶2(COX2)、iNOS、胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt蛋白表达水平.结果 0.01～20 μg/mL LPS诱导对BV2 小胶质细胞的细胞活力无显著影响,1 μg/mL LPS诱导显著上调了细胞中NO含量;槟榔碱在 10～40 μmol/L内对细胞活力无显著影响,且均可缓解LPS诱导的BV2 小胶质细胞损伤.与模型组相比,槟榔碱组可降低细胞内NO含量,下调炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β mRNA相对表达量及其血清水平;抑制TLR4、p-P65、iNOS、COX2、PI3K、p-Akt蛋白表达量.结论 槟榔碱对LPS诱导的BV2 小胶质细胞炎症模型具有显著改善作用,其作用机制可能与抑制NO生成、下调iNOS表达、调控TLR4/核因子-κB(NF-κB)、PI3K/Akt信号通路有关.

目的:探究姜黄素通过调控缺氧诱导因子-1α/微小RNA-760/潜在转化生长因子结合蛋白2(HIF-1α/miR-760/LTBP2)机制轴抑制口腔黏膜下纤维化的效果.方法:40只SD大鼠中随机取10只作为正常组,正常饲养不作处理;另30只大鼠采用槟榔碱诱导建立口腔黏膜下纤维化模型.将30只模型大鼠随机分为模型组、姜黄素组和阳性对照组,每组10只.姜黄素组和阳性对照组大鼠分别予以相应药物,正常组和模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃,1次/d,连续给药8周.比较各组大鼠张口度、颊黏膜组织变化、纤维化标志物及HIF-1α/miR-760/LTBP2信号轴表达情况.结果:与正常组比较,模型组大鼠张口度明显减小(P＜0.05),颊黏膜评分、颊黏膜组织TGF-β1、Col Ⅲ、IFN-γ水平、miR-760 mRNA、HIF-1α mRNA、LTBP2 mRNA及HIF-1α、LTBP2蛋白表达均明显升高(P＜0.05);与模型组比较,姜黄素组和阳性对照组张口度均明显增大(P＜0.05),颊黏膜评分、TGF-β1、Col Ⅲ、IFN-γ水平、miR-760 mRNA、HIF-1α mRNA、LTBP2 mRNA及蛋白表达均明显降低(P＜0.05),且姜黄素组张口度大于阳性对照组(P＜0.05),颊黏膜评分、TGF-β1、Col Ⅲ、IFN-γ、miR-760 mRNA、LTBP2 mRNA及HIF-1α、LTBP2蛋白表达均低于阳性对照组(P＜0.05).结论:姜黄素可能降低HIF-1α、miR-760、LTBP2表达,抑制口腔黏膜下纤维化.

目的:通过黏膜下注射槟榔碱溶液构建SD大鼠口腔黏膜下纤维化(OSF)模型.方法:将 20 只SD大鼠随机分为实验组和对照组.实验组大鼠采用口腔颊黏膜下注射槟榔碱溶液进行造模,对照组大鼠则注射生理盐水.处理10 周后,观察大鼠口腔黏膜颜色及体质量变化,测量被动开口度;苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色观察黏膜组织病理学变化;免疫组化染色和实时荧光定量PCR检测黏膜组织内平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血小板-内皮细胞黏附分子(PECAM-1/CD31)蛋白及基因表达水平.结果:实验组大鼠颊黏膜出现白色病变,张口度减小(P＜0.001);大鼠颊黏膜上皮萎缩,固有层胶原纤维沉积;大鼠黏膜组织内α-SMA蛋白和基因表达显著增加(P＜0.001),CD31 蛋白和基因表达显著减少(P＜0.001).结论:槟榔碱黏膜下注射法可构建出具有OSF典型症状、病理变化符合OSF的大鼠模型.

目的 研究小儿化积颗粒对幼龄大小鼠胃肠功能的影响,并对其主要药效物质进行质量控制.方法 采用幼龄小鼠肠推进、胃排空实验以及大鼠胃液分泌实验进行药效学研究;采用高效液相色谱法和电位滴定法依次对小儿化积颗粒中药效物质槟榔碱和有机酸进行含量测定.结果 小儿化积颗粒能够显著延长幼龄小鼠肠推进百分率(P＜0.05),显著减少幼龄小鼠胃中酚红残留率(P＜0.001),显著增加大鼠胃液体积和胃蛋白酶活性(P＜0.05、0.01、0.001),显著提高胃酸分泌速度(P＜0.05、0.01).建立了槟榔碱以及有机酸含量测定的方法,方法学研究结果均符合规定,3批小儿化积颗粒中试样品含量稳定.结论 小儿化积颗粒能够显著促进幼龄大小鼠胃排空,增强肠推进,改善胃液分泌功能以及胃蛋白酶活性,其作用与同剂量的化积片相当;建立的药效物质质量控制方法简单、专属性强,重复性好,可为小儿化积颗粒的临床应用提供保障.

槟榔是重要的中药材之一,生物碱是其主要活性物质,其中槟榔碱含量最高.槟榔碱因具有抗菌、促消化、抗血栓等药理作用而广泛运用,其生物安全性也备受关注.体内外研究表明,槟榔碱能造成多种细胞损害,主要是导致细胞形态的破坏,生存率的降低,生理功能异常,甚至细胞凋亡.其毒性机制的研究包括活性氧水平升高、细胞自噬作用等多个方面.本文对槟榔碱对上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、脂肪细胞、生殖细胞六种靶细胞的毒性作用及可能机制进行综述,以期为槟榔碱生物安全性研究和更为有效的临床应用提供参考.