目的:探讨微小RNA(miR)-1246靶向CXC趋化因子受体4(CXCR4)非小细胞肺癌转移特性的分子机制。方法:选取2019年7月到2021年7月河南省人民医院收集的72例非小细胞肺癌和对应癌旁组织作为研究对象，采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法分析肿瘤组织和癌旁组织中miR-1246的表达水平。人非小细胞肺癌H1299细胞系随机分为miRNA对照组和miR-1246组，采用miRNA对照和miR-1246慢病毒感染，建立稳定细胞系。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验、Transwell和上皮间质转化分析miR-1246对非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化的影响。采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-1246的靶基因。采用蛋白质免疫印迹(Western blot)分析靶蛋白表达水平。组间比较采用 t检验。 结果:癌旁组织中miR-1246表达水平(1.07±0.19)明显高于miR-1246组(0.66±0.13)，差异有统计学意义( t＝15.860， P<0.05)。miRNA对照组吸光度值(1.95±0.06)明显高于miR-1246组(1.58±0.07)，差异有统计学意义( t＝10.090， P<0.05)。miRNA对照组划痕愈合率[(90.20±6.57)%]明显高于miR-1246组[(74.56±9.36)%]，差异有统计学意义( t＝3.351， P<0.05)。miRNA对照组细胞侵袭数量[(131.00±16.37)个]明显高于miR-1246组[(94.17±5.19)个]，差异有统计学意义( t＝5.177， P<0.05)。miRNA对照组细胞上皮细胞标志物E-钙黏素(E-cadherin)和细胞角蛋白(cytokeratins)表达水平(0.87±0.06、0.71±0.06)明显低于miR-1246组(1.27±0.04、1.23±0.15)，差异有统计学意义( t＝14.240、7.839， P<0.05)。miRNA对照组细胞间质细胞标志物N-钙黏素(N-cadherin)和TWIST1表达水平(1.14±0.14、1.25±0.05)明显高于miR-1246组(0.81±0.05、0.92±0.03)，差异有统计学意义( t＝5.574、14.270， P<0.05)。CXCR4是miR-1246的靶基因。癌旁组织CXCR4蛋白表达水平(1.03±0.13)明显低于非小细胞肺癌组织(2.12±0.17)，差异有统计学意义( t＝15.860， P<0.05)。miRNA对照组细胞CXCR4蛋白表达水平(1.17±0.11)明显低于miR-1246组(0.80±0.07)，差异有统计学意义( t＝6.789， P<0.05)。 结论:miR-1246通过靶向调节CXCR4蛋白表达水平，进而参与非小细胞肺癌的迁移、侵袭和上皮间质转化过程。

目的:探讨微小RNA(miR)-1246靶向糖原合成酶激酶3β(GSK3β)对前列腺癌(PCa)细胞迁移、侵袭和增殖的作用及分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测PCa组织及癌旁组织中差异表达的miRNA；采用实时荧光定量聚合酶连反应(qRT-PCR)技术检测PCa患者癌组织和血清中miR-1246的表达水平；采用生物信息学分析、荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR、蛋白质印迹法分析miR-1246对GSK3β的靶向调控关系。人PCa细胞DU145和LNCaP分别转染miR-1246类似物(mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-1246抑制剂(inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor)，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的增殖能力，通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移侵袭能力。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:miRNA-Seq结果显示，与癌旁组织比较，PCa组织中有15个miRNA表达显著升高，51个miRNA表达显著降低，其中miR-1246在PCa患者组织及血清中表达显著升高(组织：7.93±2.39比1.00±0.16， t＝10.070， P<0.01；血清：15.23±2.77比1.01±0.09， t＝17.770， P<0.01)。生物信息分析结果显示，miR-1246与GSK3β有互补的核苷酸序列，miR-1246 mimics＋WT-GSK3β组细胞荧光素酶活性显著低于NC mimics＋WT-GSK3β组(0.58±0.09比1.00±0.14， t＝8.128， P<0.01)。蛋白质免疫印迹结果显示，miR-1246 inhibitor组GSK3β的表达明显高于NC inhibitor组(2.43±0.29比1.00±0.09， t＝10.180， P<0.01)，miR-1246 mimics组GSK3β的表达明显低于NC mimics组(0.51±0.07比1.01±0.12， t＝5.120， P<0.05)。在DU145和LNCaP细胞中，miR-1246 mimics组细胞增殖能力、细胞迁移率和细胞侵袭数显著高于NC mimics组，miR-1246 inhibitor组细胞增殖能力、细胞迁移率和细胞侵袭数显著低于NC inhibitor组。蛋白质免疫印迹实验结果显示，miR-1246 inhibitor组Wnt3a和β-catenin的表达低于NC inhibitor组(Wnt3a：0.39±0.05比1.00±0.12， t＝6.620， P<0.01；β-catenin：0.54±0.09比0.98±0.10， t＝6.032， P<0.01)。 结论:miR-1246通过抑制GSK3β，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进PCa细胞的迁移、侵袭和增殖。

目的 探讨外泌体来源的miR-1246对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)转移和自噬的影响.方法 用外泌体提取试剂盒提取ESCC细胞外泌体,电镜观察形态,纳米粒径分析仪检测粒径,Western blot法检测外泌体标志物TSG101和Calnexin的表达情况.对ESCC细胞与正常食管上皮细胞外泌体进行RNA测序,分析差异表达微小核糖核酸(microRNA,miRNA),并对差异表达miRNA进行KEGG Pathway富集分析.通过转录组测序评价155例ESCC患者的癌组织和癌旁组织中miR-1246的表达水平.Transwell小室试验检测miR-1246对ESCC细胞迁移能力的影响;Western blot法检测miR-1246对ESCC细胞自噬的影响.结果 ESCC细胞来源的外泌体形状完整,近似球形囊泡样结构;粒径为50～80nm;外泌体标志物TSG101蛋白呈阳性,Calnexin蛋白呈阴性.ESCC细胞与正常食管上皮细胞外泌体有59个共同差异表达miRNA,外泌体miR-1246在ESCC细胞中呈高表达,差异表达miRNA主要富集在自噬代谢通路上.外泌体miR-1246在ESCC患者的癌组织中呈高表达.过表达miR-1246可显著促进ESCC细胞的迁移和自噬(t分别为4.119和48.150,P分别＜0.05和＜0.001),抑制表达miR-1246可抑制ESCC细胞的迁移和自噬(t分别为9.067和51.270,P分别＜0.01和＜0.001).结论 外泌体来源的miR-1246可显著影响ESCC细胞的转移和自噬.

目的 阐明长基因间非蛋白质编码RNA 1089(LINC01089)调控微小RNA-1246(miR-1246)在胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用.方法 采用实时定量PCR(qPCR)检测LINC01089 和miR-1246 在人胰腺癌细胞(CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1、SW1990、BxPC-3)的表达.选择 BxPC-3 细胞并分为对照组、pcDNA3.1 组、LINC01089 过表达组(转染 pcDNA3.1-LINC01089)和LINC01089+miR-1246 过表达组(转染pcDNA3.1-LINC01089 和miR-1246 模拟物mimics).活细胞计数试剂盒-8、划痕和 Transwell 小室实验评价细胞增殖、迁移和侵袭能力.双荧光素酶报告基因实验和 qPCR 验证 miR-1246 与LINC01089 和囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的靶向关系,qPCR和Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)3、Snail和CFTR的表达情况.结果 与人正常胰腺导管细胞 HPDE相比,胰腺癌细胞的 LINC01089 低表达而 miR-1246 高表达(P＜0.05).与对照组相比,LINC01089 过表达组细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制,且MMP3 和Snail表达水平降低(P＜0.05).与LINC01089 过表达组相比,LINC01089+miR-1246 过表达组细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强,且MMP3 和Snail表达水平升高(P＜0.05).LINC01089 可靶向调控miR-1246 的表达而CFTR为miR-1246 的靶基因.结论 LINC01089 可能通过miR-1246 介导CFTR表达下调来抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,LINC01089/miR-1246 轴有望成为胰腺癌防治的靶点.

目的 检测氧化应激引起人视网膜血管内皮细胞(HMREC)损伤过程中微小RNA(miRNA)表达谱的改变,并探讨这些差异性表达的miRNA在视网膜血管内皮损伤过程中的作用.方法 利用不同浓度的H2 O2溶液孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立氧化应激模型,并用CCK-8细胞增殖实验检测细胞活性.采用基因芯片技术检测氧化应激介导的HUVEC中miRNA表达谱的变化,对差异性表达的miRNA进行生物信息学分析,用实时PCR方法在HMREC中进行验证.结果 CCK-8检测HUVEC活力的结果显示,与同一时间对照组相比,100 μmol/L H2O2干预组8h和16 hHUVEC存活率未发生明显改变(F100μmol/L=3.897,P＞0.05),其他浓度H2O2干预组细胞存活率明显下降(F200μmol/L=8.172、F800μmol/L=239.214,P均＜0.05),且呈剂量和时间依赖性.400 μmol/L干预组24 h细胞存活率下降接近50％(F400μmol/L=6.905,P＜0.05).微阵列分析显示,H2O2(400 μmol/L)孵育HUVEC24 h后,共有116个miRNA的表达发生改变.其中有11个miRNA表达差异在1.5倍以上.生物信息学分析提示,差异表达的miRNA可能参与细胞的代谢调节、AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号通路等多个生物学过程.实时PCR检测证实,在经过400 μmol/L H2O2处理24 h后的HUVEC和HMREC的氧化应激模型中,miRNA-15b、miRNA-106b、miRNA-497均显著下调(FmiRNA-15b,HUVEC=9.9、FmiRNA-106b,HUVEC=8.4、FmiRNA-497,HUVEC=63.5、FmiRNA-15b,HMREC=643.7、FmiRNA-106b,HMREC=81.4、FmiRNA-497,HMREC=199.9,P均＜0.05),而miRNA-195、miRNA-638、miRNA-1246、miRNA-4267和miRNA-4734均显著上调(FmiRNA-195,HUVEC=592.1、FmiRNA-638,HUVEC=812、FmiRNA-1246,HUVEC=58.5、FmiRNA-4267,HUVEC=1 179.1、FmiRNA-4734,HUVEC=173、FmiRNA-195,HMREC=67.8、FmiRNA-638,HMREC=103.7、FmiRNA-1246,HMREC=2 078.9、FmiRNA-4267,HMREC=234.6、FmiRNA-4734,HMREC=10.7,P均＜0.05).结论 氧化应激可导致HMREC中多个miRNA表达失衡,这些差异性表达的miRNA可能通过AMPK信号通路,在视网膜血管内皮损伤过程中发挥潜在作用.

目的 探讨慢病毒介导的微小RNA(miR)-1246表达下调后,对子宫颈癌细胞系SiHa细胞生物学行为的影响,以及对其下游蛋白表达的调控作用.方法 针对人miR-1246的靶序列合成含有反向互补序列的寡核苷酸片段并克隆至慢病毒载体,构建重组慢病毒LV-miR-1246-抑制物(inhibitor).实验分为3组,即抑制组(感染重组慢病毒LV-miR-1246-inhibitor)、阴性对照组(LV-NC组,感染空载体病毒颗粒)和空白对照组(NC组,无干预措施仅加培养基).采用逆转录(RT)-PCR技术检测3组SiHa细胞中miR-1246的表达水平,活细胞计数(CCK-8)法、体外侵袭实验、流式细胞仪分别检测3组SiHa细胞的增殖、侵袭、凋亡情况.建立子宫颈癌裸鼠移植瘤模型,观察miR-1246表达下调对移植瘤生长的影响,蛋白印迹(western blot)法检测3组裸鼠移植瘤组织中血小板反应蛋白2(THBS2)及基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9蛋白的表达.结果 (1)miR-1246表达:抑制组SiHa细胞中miR-1246表达水平(0.11±0.13)明显低于LV-NC组、NC组(分别为1.14±0.86、1.30±0.73,P<0.01).(2)增殖能力:培养不同时间(分别为24、48、72、96 h)后,抑制组SiHa细胞的A值均明显低于LV-NC组、NC组,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01).(3)侵袭能力:抑制组的穿膜细胞数[(71±4)个]明显少于LV-NC组、NC组[分别为(162±5)、(188±5)个,P<0.01].(4)细胞凋亡率:抑制组SiHa细胞凋亡率[(16.10±3.37)％]明显高于LV-NC组、NC组[分别为(5.67±0.89)％、(1.78±0.08)％,P<0.01].(5)移植瘤体积:抑制组裸鼠移植瘤体积[(287±59)mm3]明显小于LV-NC组、NC组[分别为(571±137)、(657±144)mm3,P<0.01].(6)与LV-NC组、NC组比较,抑制组裸鼠移植瘤组织中THBS2蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),而MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平明显下降(P<0.01).结论 子宫颈癌SiHa细胞中miR-1246的表达下调后,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞侵袭能力;其机制可能是通过上调THBS2蛋白的表达,进一步影响MMP的表达而实现.

巨噬细胞按表型和分泌的细胞因子主要分为两种不同的极化类型,即发挥"促炎和杀伤"作用的M1型极化和主导"抗炎和修复"功能的M2型极化.越来越多的研究发现,非编码RNA可靶向调控巨噬细胞极化通路中的关键蛋白而影响巨噬细胞极化状态,介导多种疾病的发生发展.非编码RNA(miRNA、lncRNA和circRNA)在调控巨噬细胞极化中发挥重要作用.其中,促进M1型巨噬细胞极化的miRNA主要有miR-27a、miR-223及let-7d-3p,促进M2型巨噬细胞极化的miRNA主要有miR-181、miR-93、miR-1246及miR-26a.lncRNA E330013P06、TCONS_00019715及基因间转录超保守RNA uc.306在M1巨噬细胞中高表达,lncRNA KCNQ1OT1、lncRNA Mirt2、lncRNA GAS5、、lncRNA cox-2及lncRNA MALAT1主要影响M2型巨噬细胞极化.circHECTD1、circZC3H4 RNA及mcircRas-GEF1B亦可调节M1/M2平衡,是肿瘤研究的热点.

目的:探讨微小RNA-1246(miR-1246)过表达增强宫颈癌细胞放疗敏感性的分子机制.方法:运用脂质体2000将miR-1246模拟物(miR-1246 mimic)转染4种宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、C33A和SiHa,以阴性对照模拟物(NC-mimic)为阴性对照.Real-time PCR检测宫颈癌组织、正常组织、子宫内膜上皮细胞系ESC和4株宫颈癌细胞中miR-1246的表达水平;转染的细胞经电离辐射照射后运用MTT法和Transwell法分别测定细胞活力和细胞迁移能力;运用免疫荧光法检测γH2AX表达水平;Western blot检测细胞中γH2AX、ATM、p-ATM和p-p53的蛋白水平.结果:miR-1246在正常组织和ESC细胞中高表达,而在4株宫颈癌细胞和宫颈癌组织中低表达;转染miR-1246 mimic后miR-1246表达水平显著高于NC-mimic组细胞(P<0.05).相同条件下,辐照后miR-1246过表达组宫颈癌细胞活力显著低于NC-mimic组,细胞迁移率明显降低(P<0.05).免疫荧光结果显示,miR-1246过表达显著增强电离辐射诱导的γH2AX激活(P<0.05);Western blot结果显示,与NC-mimic组比较,miR-1246过表达显著促进电离辐射诱导γH2AX蛋白的表达,减低p-ATM和p-p53的蛋白水平(P<0.05).结论:miR-1246在正常组织和子宫内膜上皮细胞中高表达,而在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中低表达;miR-1246过表达抑制宫颈癌细胞活力和迁移能力,并可能通过阻断ATM通路、抑制DNA损伤修复而增强宫颈癌细胞的辐射敏感性.

目的 探讨舌鳞癌细胞线粒体微小RNA(mitochondrial microRNAs,mitomiRs)的表达,筛选出与化疗耐药相关的mitomiRs.方法 提取舌鳞癌细胞系CAL-27及其顺铂耐药细胞株CAL-27-re的线粒体、细胞质、总细胞RNA,采用高通量miRNA芯片筛选出耐药和亲本细胞中差异表达的mitomiRs,应用qRT-PCR验证在CAL-27和CAL-27-re中表达上调的mitomiRs,并在化疗耐药及敏感的舌鳞癌患者样本中验证表达上调的mit-omiRs.结果 芯片结果显示,在CAL-27和CAL-27-re的线粒体、细胞质和总细胞RNA共6个组分中共检测到263个miRNA,其中共有57个mitomiRs和134个细胞质微小RNA(cytoplasmic microRNAs,cytomiRs);与总miR-NA相比,CAL-27-re细胞中有35个mitomiRs表达上调,CAL-27细胞中有31个mitomiRs表达上调(≥1.5倍).进一步比较分析亲本和耐药细胞中差异表达的mitomiRs,在CAL-27-re细胞中有miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449、miR-1268a、miR-1246、miR-371a-5p、miR-3934-5p、miR-4271、miR-513p、miR-664b-3p共11个mi-tomiRs表达上调;而5个表达下调的mitomiRs则分别是miR-188-5p、miR-1973、miR-3653、miR-4499、miR-5787;其他41个mitomiRs在两种细胞株中的表达水平几乎相同.qRT-PCR与miRNAs芯片结果相符合,并且在CAL-27和CAL-27-re中得到验证的11个表达上调的mitomiRs中,有miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449共5个mitomiRs在化疗耐药舌鳞癌临床样本中也同样表达上调.结论 顺铂化疗耐药和敏感的舌鳞癌细胞中存在差异表达的mitomiRs,特异高表达的mitomiRs:miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449可能在舌鳞癌化疗耐药中具有重要作用.

目的:分析三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB-231(MB-231)与其脑转移细胞系MDA-MB-231Brm(MB-231Brm)中microRNA(miRNA)的表达差异,寻找有价值的三阴性乳腺癌脑转移相关的miRNA.方法:Trizol法提取MB-231和MB-231Brm细胞总RNA,用Illumina高通量测序技术分离并检测miRNA表达情况,将其与已知的miRNA数据库比对,采用miRDeep2软件进行新的miRNA预测;使用差异基因检测法筛选差异表达的miRNA,构建差异表达谱.应用生物信息学分析进行miRNA靶基因的功能分析,并用实时荧光定量PCR(qPCR)进行验证.结果:MB-231和MB-231Brm细胞中miRNA的种类和表达存在差异,两者共有的miRNA为961种,前者自有164种,后者自有196种;与MB-231相比,MB-231Brm细胞的miRNA中,有145个表达显著上调,54个表达显著下调,1122个表达未见明显差异;差异表达分析显示,与MB-231相比,MB-231Brm中的miR-199a-3p和miR-103a-3p等表达显著增加,而miR-1246和miR-4787-5p等表达显著下降;基因本体分析(GO)发现差异表达的miRNA所调控的靶基因与细胞组分、分子功能及生物过程均相关;qPCR验证发现,与MB-231相比,miR-1246在MB-231Brm中表达显著降低且差异有统计学意义(P<0.05).结论:MB-231和MB-231Brm中存在差异表达的miRNA,且在TNBC脑转移过程中其调控的靶基因通过参与细胞组分形成、调节分子功能及调控生物过程等发挥作用;并发现miR-1246在脑转移细胞系中的表达下降,其可能通过某种途径参与TNBC脑转移的发生、发展过程.