目的:探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源外泌体微小RNA(miR)-520e对前列腺癌细胞多西他赛耐药性的影响及其机制。方法:2019年5月至2019年12月，从福建医科大学附属第一医院泌尿外科前列腺癌手术患者癌旁组织获取原代CAFs，提取并鉴定CAFs外泌体后，将其与PC-3细胞共培养，细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测其在高浓度(30 nmol/L)、低浓度(5 nmol/L)多西他赛条件下细胞增殖能力，计算细胞抑制率。构建高表达及低表达miR-520e的CAFs，提取外泌体后与PC-3细胞共培养，检测其对细胞增殖能力的影响，并计算细胞抑制率。进一步，通过蛋白质印迹法(Western blot)检测Hippo信号通路标志蛋白水平，验证此通路是否参与外泌体miR-520e调控PC-3细胞多西他赛耐药过程。使用方差分析和独立样本 t检验比较组间差异。 结果:PC-3细胞抑制率与多西他赛浓度呈正比(Pearson r＝0.826， P<0.05)；加入CAFs来源外泌体后，高、低浓度多西他赛组细胞抑制率分别为(50.510±2.389)%和(28.233±5.441)%，均低于对照组( t＝12.010， P<0.05和 t＝5.614， P<0.05)。高、低表达miR-520e外泌体处理组中，PC-3细胞抑制率分别为(26.355±1.539)%和(72.965±1.777)%，与对照组[(59.856±2.570)%]比较，差异均有统计学意义( t＝19.370， P<0.05与 t＝7.270， P<0.05)。此外，高表达miR-520e外泌体处理组LATS1表达水平低于对照组(0.481±0.005比1.765±0.015， t＝139.200， P<0.05)，YAP表达高于对照组(0.932±0.001比0.688±0.005， t＝81.850， P<0.05)；而低表达miR-520e外泌体处理组则相反，LATS1表达高于对照组(2.370±0.050比1.765±0.015， t＝16.770， P<0.05)，YAP表达则低于对照组(0.371±0.002比0.688±0.005， t＝97.190， P<0.05)。 结论:CAFs来源外泌体miR-520e通过调控Hippo通路增强前列腺癌PC-3细胞对多西他赛的耐药。

目的 筛选乳腺癌放射治疗(放疗)抵抗相关微小RNA(miRNAs),为乳腺癌患者放疗抵抗的基础研究与临床应用研究提供实验基础.方法 从基因表达综合数据库(GEO)中下载乳腺癌放疗患者相关miRNAs微阵列数据集GSE 107743,利用GEO2R分析工具筛选放疗后局部复发患者的差异表达miRNAs,mirDIP数据库预测差异表达miRNAs的靶基因,DAVID数据库对靶基因分别进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.最后采用实时荧光定量PCR在人乳腺癌细胞MCF-7中进行差异表达验证.结果 采用GEO2R分析工具筛选出9种与放疗抵抗相关的差异表达miRNAs,其中3种miRNAs(hsa-miR-600、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-591)表达上调,6种miRNAs(hsa-miR-488-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-520h、hsa-miR-488-3p、hsa-miR-744-3p、hsa-miR-103b)表达下调.靶基因预测结果显示,9种差异表达miRNAs的潜在靶基因共134个.靶基因显著富集在细胞周期、细胞凋亡、干细胞分化等相关生物学过程(均P＜0.05)以及转化生长因子-β、磷脂酰肌醇3-激酶\蛋白激酶B信号通路等信号通路中(均P＜0.05).实时荧光定量PCR检测结果表明,6种miRNAs (hsa-miR-600、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-591、hsa-miR488-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-520h)在经5 Gy 137Csγ射线辐照后的MCF-7细胞中表达差异改变与GEO2R分析结果完全一致.结论 利用生物信息学从乳腺癌放疗患者局部复发临床样本中筛选出的差异表达miRNAs可能与乳腺癌患者的放疗抵抗密切相关,有望成为放疗抵抗治疗的新靶点.

目的 探讨微小RNA(miR)-520b靶向调节肝脏磷酸果糖激酶(PFKL)在胰腺癌细胞侵袭及凋亡中的机制.方法 将细胞分为空白组、阴性对照组、miR-520b阳性组、miR-520b抑制组和siRNA-PFKL组,每组重复3次.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测miR-520b和PFKL基因相对表达量;蛋白质印迹法(Western blot)检测PFKL及上皮-间充质转化(EMT)相关分子蛋白分子水平;细胞体外侵袭实验(Transwell)和流式细胞技术分别检测细胞侵袭和凋亡能力.结果 荧光素酶报告基因检测发现,在野生型PFKL中,miR-520b阳性组(0.25 ±0.04)的荧光素酶活性较阴性对照组(0.92±0.09)显著降低(P＜0.05),而在突变型PFKL中差异无统计学意义(P＞0.05).与空白组[PFKL:1.72±0.13,N-钙黏蛋白(N-cadherin):1.36±0.10,E-钙黏蛋白(E-cadherin):1.27±0.09、β-连环蛋白(β-catenin):0.36±0.04、Snail:1.35 ±0.12、侵袭:(23.27±3.18)个/HF、凋亡:(9.89±0.72)％]和阴性对照组[PFKL:1.61±0.12,N-cadherin:1.40±0.11,E-cadherin:1.26±0.08、β-catenin:0.38±0.05、Snail:1.30±0.10、侵袭:(21.92±3.65)个/HF、凋亡:(10.67±0.69)％]比较,miR-520b阳性组[PFKL:0.12±0.01,N-cadherin:0.30±0.03,E-cadherin:2.42±0.21、β-catenin:0.19±0.02、Snail:0.40±0.07、侵袭:(12.13±1.39)个/HF、凋亡:(25.83±2.15)％]和siRNA-PFKL组[PFKL:0.11±0.01,N-cadherin:0.25±0.02,E-cadherin:2.53±0.24、β-catenin:0.26±0.05、Snail:0.22±0.04、侵袭:(13.91±1.10)个/HF、凋亡:(23.9l±1.99)％]E-cadherin蛋白和CFPAC-1细胞凋亡水平显著增高,PFKL、N-cadherin、β-catenin、Snail蛋白和细胞侵袭水平显著减低(P＜0.05);miR-520b抑制组[PFKL:3.47 ±0.25,N-cadherin:3.39±0.20,E-cadherin:0.49±0.03、β-catenin:2.11±0.15、Snail:2.05±0.22、侵袭:(43.22±7.85)个/HF、凋亡:(2.41±0.18)％]E-cadherin蛋白和CFPAC-1细胞凋亡水平显著降低,PFKL、N-cadherin、β-catenin、Snail蛋白和细胞侵袭水平显著增高(P＜0.05).结论 miR-520b可抑制胰腺癌细胞的侵袭并促进其凋亡,其机制与调控靶基因PFKL密切相关.

目的 探讨微小RNA-520e(miR-520e)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞侵袭迁移和Janus激酶1( JAK1)／信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响.方法 采用实时定量PCR(QPCR)检测人肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞株H1299、H1975、H1650、A549的miR-520e水平;体外常规培养A549细胞并采用脂质体分别转染模拟物(过表达组)和阴性对照序列(NC组),以仅经脂质体处理的细胞为对照组.采用QPCR、活细胞计数CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-520e和含锌指和BTB结构域7A(ZBTB7A)水平、增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-9、磷酸化JAK1(p-JAK1)和磷酸化STAT3(p-STAT3)水平;双荧光素酶报告基因系统联合荧光素酶报告质粒psi-CHECK-2验证miR-520e与ZBTB7A的靶向关系.结果 与正常细胞相比,NSCLC细胞的miR-520e水平降低,其中A549细胞最低,差异有统计学意义( P＜0. 05).过表达组的miR-520e水平为19. 562± 1. 448,高于对照组的1. 002± 0. 057和NC组的1. 053±0. 082,ZBTB7A水平为0. 173±0. 026,低于对照组的1. 109±0. 091和NC组的1. 076±0. 136,差异均有统计学意义(P＜0. 05).与对照组和NC组相比,过表达组转染36、48 h后的增殖活力及转染48 h后的MMP-9、p-JAK1和p-STAT3水平均降低(P＜0. 05).过表达组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(23. 618±3. 684)%和(51. 644±7. 069)个,低于对照组的(57. 089± 4. 569)%和(152. 269±12. 833)个及NC组的(59. 267±5. 671)%和(149. 075±11. 239)个( P＜0. 05). MiR-520e模拟物与携带野生型ZBTB7A 3’端非翻译区的psiCHECK-2载体共转染细胞的相对荧光强度降低(P＜0. 05).结论 miR-520e在NSCLC细胞中表达下调且可能通过靶向ZBTB7A降低JAK1／STAT3信号通路活性来抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移.

目的 探讨氧化苦参碱(OMT)通过微小RNA(miR)-520e调控星形胶质细胞瘤上调基因1(AEG-1)介导的结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响.方法 不同浓度OMT处理结肠癌细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;对数生长期的结肠癌细胞随机分为Control组、OMT组(含70μmol/L OMT的培养基培养24 h)、NC组(转染阴性对照片段24 h)、miR-520e inhibitor组(转染miR-520e抑制物24 h)和OMT+miR-520e inhibitor组(转染miR-520e抑制物24 h后,70μmol/L OMT处理24 h),MTT法检测细胞存活率,PCR检测miR-520e表达水平,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,双荧光素酶报告实验检测miR-520e与AEG-1靶向关系,蛋白印迹法检测AEG-1、白介素6(IL-6)和磷酸化信号转导子与激活子3(STAT3)蛋白相对表达量.结果 随着OMT浓度的增加,结肠癌细胞增殖抑制率升高(P<0.05);与Control组比较,OMT组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量降低,miR-520e表达水平以及划痕愈合率升高(P<0.05);与OMT组比较,OMT+miR-520e inhibitor组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量升高,miR-520e表达水平以及划痕愈合率降低(P<0.05);与NC组比较,miR-520e inhibitor组侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量升高,miR-520e表达水平以及划痕愈合率降低(P<0.05);与miR-520e inhibitor组比较,OMT+miR-520e inhibitor组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量降低,miR-520e表达水平以及划痕愈合率升高(P<0.05).结论 OMT通过上调miR-520e抑制AEG-1表达,降低结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力.

目的 探讨微小RNA-520a-5p(miR-520a-5p)在胶质瘤发生发展中的作用和机制.方法 选取2016年5月至2018年11月在宝鸡高新人民医院治疗的胶质瘤病人肿瘤组织作56例为研究对象.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测56例胶质瘤组织和56例正常脑组织中miR-520a-5p表达水平.体外培养胶质瘤U251细胞,转染miR模拟对照序列(miR-NC)、miR-520a-5p9模拟物(miR-520a-5p mimics)至U251细胞,分别采用四甲基噻唑蓝染色法(MTT)、流式细胞仪、Transwell和蛋白质印迹法检测过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭及细胞中鼠双微体基因(MDM2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、P21、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达的影响.双萤光素酶报告基因实验验证miR-520a-5p与MDM2靶向关系,蛋白质印迹法检测转染miR-520a-5p mimics、miR-520a-5p抑制剂(anti-miR-520a-5p)对U251细胞中MDM2蛋白表达的影响.共转染miR-520a-5p mimics和MDM2过表达载体(pcD?NA3.1-MDM2)至U251细胞,上述相同方法观察过表达MDM2能否逆转过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响.结果 与正常脑组织相比,胶质瘤组织中miR-520a-5p表达降低(P<0.05).与转染miR-NC的U251细胞比较,转染miR-520a-5p mimics的U251细胞24 h、48 h和72 h的OD值[(0.36±0.04)比(0.50±0.05)、(0.49±0.05)比(0.95±0.09)、(0.71±0.07)比(1.36±0.13)]、迁移细胞数[(67±6.26)比(144±13.38)]、侵袭细胞数[(59±5.47)比(135±13.12)]均降低(P<0.05),凋亡率[(21.17±2.06)％比(7.82±0.77)％]升高(P<0.05),细胞中cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表达水平均降低(P<0.05),而P21、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平均升高(P<0.05).miR-520a-5p可与MDM2的3'UTR靶向结合,同时转染miR-520a-5p mimics的U251细胞中MDM2蛋白水平显著低于转染miR-NC的细胞,而转染anti-miR-520a-5p的U251细胞中MDM2的蛋白水平显著高于转染anti-miR-NC的细胞.与共转染miR-520a-5p mimics与pcDNA3.1的U251细胞比较,共转染miR-520a-5p mim?ics与pcDNA3.1-MDM2的U251细胞24 h、48 h和72 h的OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数均升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05),细胞中cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表达水平均升高(P<0.05),而P21、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平均降低(P<0.05).结论 miR-520a-5p在胶质瘤组织中表达降低,过表达miR-520a-5p可能通过靶向负调控MDM2抑制胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导其凋亡.

目的 探讨微小RNA-520e(miR-520e)是否通过下调自噬调控肝癌细胞失巢凋亡抵抗.方法 选择具有高迁移潜能的人肝癌细胞株HCCLM3,使用Lipofectamine 2000将miR-520e类似物(miR-520e-mimic)和阴性对照序列(mimic NC)转染HCCLM3细胞分为miR-520e mimic组和mimic NC组.在失巢状态下,采用MTT法检测细胞生存率,采用细胞划痕实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭情况,采用免疫荧光检测细胞自噬水平,采用Western blot检测细胞人微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)和LC3-Ⅱ蛋白表达.结果 在失巢状态下,与mimic NC组比较,miR-520e-mimic组细胞生存率降低,细胞迁移下降,细胞侵袭数量减少,自噬现象被抑制,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-520e通过下调自噬介导失巢凋亡,抑制HCCLM3细胞生长、迁移和侵袭.