目的:探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源外泌体微小RNA(miR)-520e对前列腺癌细胞多西他赛耐药性的影响及其机制。方法:2019年5月至2019年12月，从福建医科大学附属第一医院泌尿外科前列腺癌手术患者癌旁组织获取原代CAFs，提取并鉴定CAFs外泌体后，将其与PC-3细胞共培养，细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测其在高浓度(30 nmol/L)、低浓度(5 nmol/L)多西他赛条件下细胞增殖能力，计算细胞抑制率。构建高表达及低表达miR-520e的CAFs，提取外泌体后与PC-3细胞共培养，检测其对细胞增殖能力的影响，并计算细胞抑制率。进一步，通过蛋白质印迹法(Western blot)检测Hippo信号通路标志蛋白水平，验证此通路是否参与外泌体miR-520e调控PC-3细胞多西他赛耐药过程。使用方差分析和独立样本 t检验比较组间差异。 结果:PC-3细胞抑制率与多西他赛浓度呈正比(Pearson r＝0.826， P<0.05)；加入CAFs来源外泌体后，高、低浓度多西他赛组细胞抑制率分别为(50.510±2.389)%和(28.233±5.441)%，均低于对照组( t＝12.010， P<0.05和 t＝5.614， P<0.05)。高、低表达miR-520e外泌体处理组中，PC-3细胞抑制率分别为(26.355±1.539)%和(72.965±1.777)%，与对照组[(59.856±2.570)%]比较，差异均有统计学意义( t＝19.370， P<0.05与 t＝7.270， P<0.05)。此外，高表达miR-520e外泌体处理组LATS1表达水平低于对照组(0.481±0.005比1.765±0.015， t＝139.200， P<0.05)，YAP表达高于对照组(0.932±0.001比0.688±0.005， t＝81.850， P<0.05)；而低表达miR-520e外泌体处理组则相反，LATS1表达高于对照组(2.370±0.050比1.765±0.015， t＝16.770， P<0.05)，YAP表达则低于对照组(0.371±0.002比0.688±0.005， t＝97.190， P<0.05)。 结论:CAFs来源外泌体miR-520e通过调控Hippo通路增强前列腺癌PC-3细胞对多西他赛的耐药。

目的 筛选乳腺癌放射治疗(放疗)抵抗相关微小RNA(miRNAs),为乳腺癌患者放疗抵抗的基础研究与临床应用研究提供实验基础.方法 从基因表达综合数据库(GEO)中下载乳腺癌放疗患者相关miRNAs微阵列数据集GSE 107743,利用GEO2R分析工具筛选放疗后局部复发患者的差异表达miRNAs,mirDIP数据库预测差异表达miRNAs的靶基因,DAVID数据库对靶基因分别进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.最后采用实时荧光定量PCR在人乳腺癌细胞MCF-7中进行差异表达验证.结果 采用GEO2R分析工具筛选出9种与放疗抵抗相关的差异表达miRNAs,其中3种miRNAs(hsa-miR-600、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-591)表达上调,6种miRNAs(hsa-miR-488-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-520h、hsa-miR-488-3p、hsa-miR-744-3p、hsa-miR-103b)表达下调.靶基因预测结果显示,9种差异表达miRNAs的潜在靶基因共134个.靶基因显著富集在细胞周期、细胞凋亡、干细胞分化等相关生物学过程(均P＜0.05)以及转化生长因子-β、磷脂酰肌醇3-激酶\蛋白激酶B信号通路等信号通路中(均P＜0.05).实时荧光定量PCR检测结果表明,6种miRNAs (hsa-miR-600、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-591、hsa-miR488-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-520h)在经5 Gy 137Csγ射线辐照后的MCF-7细胞中表达差异改变与GEO2R分析结果完全一致.结论 利用生物信息学从乳腺癌放疗患者局部复发临床样本中筛选出的差异表达miRNAs可能与乳腺癌患者的放疗抵抗密切相关,有望成为放疗抵抗治疗的新靶点.

目的 探讨微小RNA(miR)-520b靶向调节肝脏磷酸果糖激酶(PFKL)在胰腺癌细胞侵袭及凋亡中的机制.方法 将细胞分为空白组、阴性对照组、miR-520b阳性组、miR-520b抑制组和siRNA-PFKL组,每组重复3次.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测miR-520b和PFKL基因相对表达量;蛋白质印迹法(Western blot)检测PFKL及上皮-间充质转化(EMT)相关分子蛋白分子水平;细胞体外侵袭实验(Transwell)和流式细胞技术分别检测细胞侵袭和凋亡能力.结果 荧光素酶报告基因检测发现,在野生型PFKL中,miR-520b阳性组(0.25 ±0.04)的荧光素酶活性较阴性对照组(0.92±0.09)显著降低(P＜0.05),而在突变型PFKL中差异无统计学意义(P＞0.05).与空白组[PFKL:1.72±0.13,N-钙黏蛋白(N-cadherin):1.36±0.10,E-钙黏蛋白(E-cadherin):1.27±0.09、β-连环蛋白(β-catenin):0.36±0.04、Snail:1.35 ±0.12、侵袭:(23.27±3.18)个/HF、凋亡:(9.89±0.72)％]和阴性对照组[PFKL:1.61±0.12,N-cadherin:1.40±0.11,E-cadherin:1.26±0.08、β-catenin:0.38±0.05、Snail:1.30±0.10、侵袭:(21.92±3.65)个/HF、凋亡:(10.67±0.69)％]比较,miR-520b阳性组[PFKL:0.12±0.01,N-cadherin:0.30±0.03,E-cadherin:2.42±0.21、β-catenin:0.19±0.02、Snail:0.40±0.07、侵袭:(12.13±1.39)个/HF、凋亡:(25.83±2.15)％]和siRNA-PFKL组[PFKL:0.11±0.01,N-cadherin:0.25±0.02,E-cadherin:2.53±0.24、β-catenin:0.26±0.05、Snail:0.22±0.04、侵袭:(13.91±1.10)个/HF、凋亡:(23.9l±1.99)％]E-cadherin蛋白和CFPAC-1细胞凋亡水平显著增高,PFKL、N-cadherin、β-catenin、Snail蛋白和细胞侵袭水平显著减低(P＜0.05);miR-520b抑制组[PFKL:3.47 ±0.25,N-cadherin:3.39±0.20,E-cadherin:0.49±0.03、β-catenin:2.11±0.15、Snail:2.05±0.22、侵袭:(43.22±7.85)个/HF、凋亡:(2.41±0.18)％]E-cadherin蛋白和CFPAC-1细胞凋亡水平显著降低,PFKL、N-cadherin、β-catenin、Snail蛋白和细胞侵袭水平显著增高(P＜0.05).结论 miR-520b可抑制胰腺癌细胞的侵袭并促进其凋亡,其机制与调控靶基因PFKL密切相关.

目的 探讨微小RNA-520e(miR-520e)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞侵袭迁移和Janus激酶1( JAK1)／信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响.方法 采用实时定量PCR(QPCR)检测人肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞株H1299、H1975、H1650、A549的miR-520e水平;体外常规培养A549细胞并采用脂质体分别转染模拟物(过表达组)和阴性对照序列(NC组),以仅经脂质体处理的细胞为对照组.采用QPCR、活细胞计数CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-520e和含锌指和BTB结构域7A(ZBTB7A)水平、增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-9、磷酸化JAK1(p-JAK1)和磷酸化STAT3(p-STAT3)水平;双荧光素酶报告基因系统联合荧光素酶报告质粒psi-CHECK-2验证miR-520e与ZBTB7A的靶向关系.结果 与正常细胞相比,NSCLC细胞的miR-520e水平降低,其中A549细胞最低,差异有统计学意义( P＜0. 05).过表达组的miR-520e水平为19. 562± 1. 448,高于对照组的1. 002± 0. 057和NC组的1. 053±0. 082,ZBTB7A水平为0. 173±0. 026,低于对照组的1. 109±0. 091和NC组的1. 076±0. 136,差异均有统计学意义(P＜0. 05).与对照组和NC组相比,过表达组转染36、48 h后的增殖活力及转染48 h后的MMP-9、p-JAK1和p-STAT3水平均降低(P＜0. 05).过表达组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(23. 618±3. 684)%和(51. 644±7. 069)个,低于对照组的(57. 089± 4. 569)%和(152. 269±12. 833)个及NC组的(59. 267±5. 671)%和(149. 075±11. 239)个( P＜0. 05). MiR-520e模拟物与携带野生型ZBTB7A 3’端非翻译区的psiCHECK-2载体共转染细胞的相对荧光强度降低(P＜0. 05).结论 miR-520e在NSCLC细胞中表达下调且可能通过靶向ZBTB7A降低JAK1／STAT3信号通路活性来抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移.

目的 研究miR-223-3p对肺鳞癌细胞顺铂(CDDP)敏感性的影响.方法 通过分别升高或降低(miR-223-3pmimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor、NC-inhibitor)肺鳞癌NCI-H520和SK-MES-1细胞内miR-223-3p的含量后,qRT-PCR检测细胞内miR-223-3p基因表达水平;CCK-8法检测细胞半数抑制浓度(IC50);流式细胞仪检测细胞加入CDDP药物刺激后凋亡率的改变(分别设计四组不同的处理:miR-223-3p mimics+ CDDP、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor+ CD-DP、NC-inhibitor);Transweil实验检测SK-MES-1细胞迁移能力的变化;Western blot法检测SK-MES-1细胞中Bax、ZEB1和E-cadherin的变化.结果 CCK-8实验结果表明,miR-223-3p mimics组的IC50低于对照组的IC50,miR-223-3p inhibitor组的IC50高于对照组的IC50;流式细胞术凋亡检测结果显示,miR-223-3p mimics+CDDP(80 μmol/L)组细胞凋亡率增加,而miR-223-3p inhibitor+ CDDP(80 μmol/L)组细胞凋亡率减少;Western blot证实,同时分别升高或降低肺鳞癌细胞内的miR-223-3p含量后,ZEB1蛋白相应的降低和升高,且Bax、E-cadherin蛋白相应的升高和降低.结论 miR-223-3p作为抑癌基因影响肺鳞癌细胞对CDDP的敏感性,可作为治疗肺鳞癌CDDP耐药的重要分子靶标.

目的 探讨miR-520a-3p对胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭的影响.方法 运用qRT-PCR检测胶质瘤细胞U251、T98G和正常人星形胶质细胞NHA中miR-520a-3p的表达水平;将胶质瘤细胞U251、T98G分为miR-NC组、miR-520a-3p组、si-NC组、si-NEK2组、pcDNA3.1-NEK2+miR-NC组、pcDNA3.1-NEK2+miR-520a-3p组.采用CCK-8法检测细胞增殖情况;Transwell检测胶质瘤细胞的迁移和侵袭;流式细胞术检测胶质瘤细胞凋亡率;Western印迹检测蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性.结果 相较于正常人星形胶质细胞NHA,胶质瘤细胞U251、T98G中miR-520a-3p的表达水平显著降低(P<0.05);过表达miR-520a-3p可抑制胶质瘤细胞U251、T98G增殖,促进细胞凋亡;可抑制T98G细胞迁移和侵袭;抑制Bcl-2、MMP-2蛋白的表达,促进Bax、E-cadherin蛋白的表达.miR-520a-3p靶向调控NEK2的表达.抑制NEK2表达可抑制T98G增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡.过表达NEK2能逆转miR-520a-3p对胶质瘤细胞T98G增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡的促进作用.结论 miR-520a-3p可通过下调NEK2抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡.

目的:研究hsa_circ_ 0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路调控前列腺癌的进展的分子机制.方法:核质分离检测hsa_circ_0005221和miR-339-5p在细胞中的表达定位;Pulldown检测hsa_circ_0005221结合的miRNA;软件预测结合荧光素酶报告基因确定与hsa_circ_0005221结合的RNA是miR-339-5p;定量PCR检测hsa_circ_0005221在前列腺上皮细胞和前列腺癌细胞的表达量;在前列腺癌细胞分别转染hsa_ circ__ 0005221过表达质粒和siRNA测DU145和LNCaP增殖、侵袭和迁移能力及上皮间质转化(EMT)和凋亡水平;在敲低hsa_circ_ 0005221基础上,转染miR-339-5P mimics和inhibitor测DU145和LNCaP增殖、侵袭和迁移能力及EMT标志性蛋白、STAT5A和凋亡水平.结果:hsa_circ_ 0005221在前列腺癌细胞的表达水平明显高于前列腺上皮细胞.核质分离实验表明hsa_circ_0005221、miR-339-5P均主要在胞质中表达.在DU145和LNCaP敲低hsa_circ_ 0005221,其增殖、侵袭、迁移及EMT能力明显下降;凋亡水平增加.过表达hsa_ circ_ 0005221则结果相反.在软件预测排名前5的miRNA中,Pulldown实验结果显示与hsa_circ_0005221结合的有miR-339-5P、miR-17、miR-520H;敲低或过表达hsa_circ_0005221,miR-339-5P变化最明显.荧光素酶报告基因结果显示hsa_circ_0005221与miR-339-5P结合.在DU145和LNCaP敲低hsa_circ_ 0005221基础上转染miR-339-5P mimics,其增殖、侵袭和迁移能力明显下降,凋亡水平增加,E-cad水平增加,N-cad水平下降,STAT5A表达水平增加.敲低hsa_circ_0005221基础上上转染miR-339-5P mimics则结果相反.结论:hsa_circ_ 0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路促进前列腺癌的进展.

目的 探讨miR-520a-3p在肾癌细胞系中的表达水平及其对肾癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响.方法 通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测miR-520a-3p在正常肾小管上皮细胞HK2和肾癌细胞系786-O、A498、OS-RC-2及ACHN中的表达水平.选取miR-520a-3p表达水平最低的肾癌细胞系786-O和A498为实验对象,各分为两组:对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-520a-3p模拟物).采用CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验、流式细胞术检测各组细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡情况;采用Western blotting验证相关蛋白表达量变化.采用生物信息学软件预测miR-520a-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证其靶向关系.结果 相对于HK2细胞,miR-520a-3p在多种肾癌细胞系中表达明显降低(P<0.05),在786-O和A498细胞中降低最明显(P<0.05).转染miR-520a-3p模拟物后,实验组的细胞增殖、迁移和侵袭能力明显降低,凋亡率增加(P<0.05),N-cadherin、Bcl2、Bcl3蛋白表达量明显降低,E-cadherin蛋白表达量明显增高.生物信息学软件预测miR-520a-3p与Bcl3存在可结合位点,双荧光素酶报告实验证实miR-520a-3p可直接靶向Bcl3.结论 miR-520a-3p在肾癌细胞系中低表达,过表达miR-520a-3p可抑制肾癌细胞系786-O和A498增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡.

目的 通过构建鼻咽癌微小核糖核酸(miRNA)调控网络筛选与鼻咽癌发病相关的分子标志物.方法 从基因表达数据库(GEO)数据库下载鼻咽癌miRNA芯片数据GSE70970和基因芯片数据GSE12452,利用R软件筛选出差异表达miRNA和mRNA,并对其进行功能富集分析.应用FunRich软件预测差异miRNA的转录因子及靶基因,将靶基因与差异基因取交集获得核心基因,并通过Cytoscape软件构建miRNA-mRNA调控网络.通过Kaplan-Meier plotter数据库对核心基因进行生存分析.结果 一共筛选出47个差异表达miRNA、797个差异表达基因.功能富集分析表明差异表达的miRNA主要参与信号转导、转录调控等过程,差异表达基因主要参与细胞因子受体相互作用、细胞周期、小细胞肺癌等信号通路.靶基因与差异表达基因取交集后筛选出23个核心基因,构建miRNA-mRNA调控网络.生存分析显示其中4个核心基因对鼻咽癌患者的预后有影响,包括多聚磷酸肌醇磷酸酶1(MINPP1)、锌指环指蛋白3(ZNRF3)、纤毛顶结构蛋白(SNTN)、β微管蛋白2A(TUBB2A),其相对应的miRNA分别为hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-107、hsa-miR-421.结论 通过构建miRNA-mRNA调控网络同时结合生存分析,筛选鼻咽癌相关的分子标志物,为鼻咽癌诊断、治疗提供潜在的分子靶点.

目的 探讨氧化苦参碱(OMT)通过微小RNA(miR)-520e调控星形胶质细胞瘤上调基因1(AEG-1)介导的结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响.方法 不同浓度OMT处理结肠癌细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率;对数生长期的结肠癌细胞随机分为Control组、OMT组(含70μmol/L OMT的培养基培养24 h)、NC组(转染阴性对照片段24 h)、miR-520e inhibitor组(转染miR-520e抑制物24 h)和OMT+miR-520e inhibitor组(转染miR-520e抑制物24 h后,70μmol/L OMT处理24 h),MTT法检测细胞存活率,PCR检测miR-520e表达水平,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,双荧光素酶报告实验检测miR-520e与AEG-1靶向关系,蛋白印迹法检测AEG-1、白介素6(IL-6)和磷酸化信号转导子与激活子3(STAT3)蛋白相对表达量.结果 随着OMT浓度的增加,结肠癌细胞增殖抑制率升高(P<0.05);与Control组比较,OMT组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量降低,miR-520e表达水平以及划痕愈合率升高(P<0.05);与OMT组比较,OMT+miR-520e inhibitor组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量升高,miR-520e表达水平以及划痕愈合率降低(P<0.05);与NC组比较,miR-520e inhibitor组侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量升高,miR-520e表达水平以及划痕愈合率降低(P<0.05);与miR-520e inhibitor组比较,OMT+miR-520e inhibitor组细胞存活率、侵袭细胞数以及AEG-1、IL-6和p-STAT3蛋白相对表达量降低,miR-520e表达水平以及划痕愈合率升高(P<0.05).结论 OMT通过上调miR-520e抑制AEG-1表达,降低结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移能力.