目的 探讨长链非编码核糖核酸(lncRNA)AFAP1-AS1及微小核糖核酸-195-5p(miR-195-5p)对肝细胞癌(HCC)细胞生物学行为的影响.方法 常规培养人HCC细胞系(HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel7402、SK-hep1细胞)和正常人肝细胞(HL-7702细胞),用实时荧光定量PCR法检测AFAP1-AS1、miR-195-5p并筛选实验细胞.将对数生长期实验细胞随机分为si-AFAP1-AS1组、si-NC组,miR-195-5p mimics组、mimics-NC组,miR-195-5pinhibitor+si-NC组、miR-195-5p inhibitor+si-AFAP1-AS1 组、inhibitor-NC+si-AFAP1-AS1 组、inhibitor-NC+si-NC组,用Lipofectamine 2000试剂将相应质粒按照分组转染入细胞.用CCK-8实验、菌落形成实验检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,用Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力,用双荧光素酶报告基因实验验证AFAP1-AS1与miR-195-5p的靶向关系.结果 HCC细胞中AFAP1-AS1表达高于正常人肝细胞(P均<0.05),HCC细胞中miR-195-5p表达低于正常人肝细胞(P均<0.05).由于SK-hep1细胞中AFAP1-AS1表达最高、miR-195-5p表达最低,因此,后续研究均采用SK-hep1细胞进行实验.与si-NC组比较,si-AFAP1-AS1组中AFAP1-AS1表达低、细胞增殖能力低、迁移和侵袭细胞少、G0/G1期细胞比例高、细胞凋亡率高(P均<0.05).通过Starbase v3.0在线数据库预测发现,AFAP1-AS1与miR-195-5p有互补的结合位点.双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-NC组、miR-195-5p组共转染WT-AFAP1-AS1后相对荧光素酶活性比较差异有统计学意义(P<0.05),共转染MUT-AFAP1-AS1后相对荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05).与inhibitor-NC+si-NC组比较,si-NC+miR-195-5p inhibitor组细胞增殖能力高、迁移和侵袭细胞多、G0/G1 期细胞比例低、细胞凋亡率低(P均<0.05),而si-AFAP1-AS1+miR-195-5p inhibitor组上述细胞生物学行为则相反.结论 lncRNA AFAP1-AS1可能通过竞争性结合miR-195-5p参与调控HCC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为.

目的 分析宫颈癌患者微小核糖核酸(miR)-34a、miR-145、miR-21及Ki-67的表达与人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系.方法 选择2020年1月-2022年11月新乡市中心医院收治的189例宫颈癌患者纳入宫颈癌组,宫颈上皮内瘤变(CIN)患者190例纳入CIN组,宫颈炎患者195例纳入宫颈炎组,检测三组患者miR-34a、miR-145、miR-21及Ki-67表达情况,分析宫颈不同病变HPV阳性率及HPV-DNA负荷量表达.结果 宫颈炎组、CIN组、宫颈癌组miR-34a、miR-145表达水平呈降低趋势,miR-21表达水平及Ki-67阳性率呈升高趋势(P＜0.05);随着病情加重,HPV阳性率和HPV-DNA表达水平逐渐升高(P＜0.05);HPV阳性宫颈癌患者miR-34a、miR-145表达水平低于HPV阴性患者,miR-21表达水平高于HPV阴性患者(P＜0.05).结论 miR-34a、miR-145、miR-21及Ki-67的表达及HPV感染可参与慢性子宫颈炎-CIN-宫颈癌的病情发展,且miR-34a、miR-145、miR-21表达水平与HPV感染有关,可作为临床诊治的新靶点.

目的:探讨大鼠脊神经结扎术后脊髓背角小胶质细胞中微核糖核酸-195 (microRNA-195,miR-195)的表达及其对自噬水平的影响与调节机制.方法:32只成年雄性SD大鼠随机分为脊神经结扎组(SNL组)和假手术组(S组),每组16只,SNL组结扎L5段神经制备脊神经结扎模型,造模后1d、3d、5d、10d两组各处死4只大鼠,分离脊髓腰膨大,采用Percoll梯度离心法分离脊髓背角小胶质细胞,Real-time PCR检测两组各时间点脊髓背角小胶质细胞的miR-195表达水平.取12只成年雄性SD大鼠,处死后取脊髓腰膨大,分离脊髓背角小胶质细胞,分为两组,一组采用脂质体法转染miR-195模拟物,另一组加入转染试剂,检测两组小胶质细胞自噬体膜标记蛋白轻链3(light chain 3,LC3)的表达水平;再取小胶质细胞分为三组,分别将含有野生型及突变型自噬相关基因14(ATG14)3'非编码区(3'UTR)的报告基因质粒、pRL-TK质粒miR-195模拟物和对照转入HEK 293细胞培养48h,荧光显微镜下观察miR-195的直接作用靶点,并检测三组ATG14蛋白的表达.取24只健康SD大鼠脊髓腰膨大,分离脊髓背角小胶质细胞,分为三组分别转染miR-195模拟物、抑制物和转染试剂,培养48h,采用免疫蛋白印记(Westem blot)法检测三组ATG14蛋白的表达水平;再取小胶质细胞分为三组,分别转染pEGFP-LC3、pEGFP-LC3+miR-195模拟物及pEGFP-LC3+miR-195模拟物+pCMV-ATG14培养48h,染色后荧光显微下观察自噬斑点数量.结果:SNL组各时间点大鼠脊髓背角小胶质细胞中miR-195表达均明显上调,与同时间点S组比较均有显著性差异(P＜0.05).转染miR-195模拟物后,LC3的表达水平(0.61±0.07)较对照组(1.21±0.08)显著性降低(P＜0.05).转入野生型ATG14 3'UTR的报告基因质粒的HEK 293细胞的荧光强度较对照显著性减弱(0.65±0.04 vs 1.01±0.01,P＜0.05),突变型与对照无显著性变化(0.99±0.03 vs1.00±0.02,P＞0.05).转染miR-195模拟物后小胶质细胞中ATG14的表达显著性降低(P＜0.05);转染miR-195抑制物后ATG14的表达显著性升高(P＜0.05).转染pEGFP-LC3与pEGFP-LC3+miR-195模拟物较转染pEGFP-LC3+miR-195模拟物+pCMV-ATG14时自噬数量降低(P＜0.05).结论:miR-195在大鼠脊神经结扎模型脊髓背角小胶质细胞中高表达,降低自噬蛋白LC3表达;ATG14蛋白受miR-195负调控,miR-195可能通过降低ATG14的表达抑制小胶质细胞自噬.

目的 检测微小核糖核酸(microribonucleicacids,miRNA)在老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)患者中的表达,并探讨miRNA的表达量与AMD病程之间的关系.方法 选取2014年1月至2016年11月于同济大学附属第十人民医院眼科门诊就诊的AMD患者6例为试验组,并选取同期6名正常人为对照组,通过基因芯片技术检测两组血液中miR-NA的表达量.扩大样本的病例对照研究中共纳入126例AMD患者和140名正常人,检测其血液样本中miRNA的表达,比较两组人群间miRNA的表达量差异.结果 通过基因芯片技术,在试验组与对照组间共检测出216个miRNA存在表达差异(均为P＜0.05),与对照组相比,试验组中111个miRNA表达量上升,105个miRNA表达量下降,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).扩大样本的病例对照研究结果表明,在AMD患者中,miR-27a-3p、miR-29b-3p、miR-195-5p的表达量显著上升,同时,湿性AMD患者血液中miR-27a-3p的表达量高于干性AMD患者,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 AMD患者外周血中miRNA表达量水平有明显变化,miR-27a-3p、miR-29b-3p、miR-195-5p可能成为AMD血清学诊断和预后的标志物.

目的 探讨微小RNA-195(miR-195)在胃癌干细胞中的作用及其调控机制.方法 通过干细胞标记物CD44分选胃癌干细胞,采用实时定量PCR方法检测胃癌干细胞中miR-195 mRNA表达.使用慢病毒表达载体构建miR-195稳定表达细胞系,采用体外成球实验和Transwell实验检测其自我更新能力和侵袭能力,生物信息学进行miR-195靶基因预测,Western blot法检测Akt3蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-195靶基因.结果 与CD44-胃癌细胞相比,miR-195在CD44+胃癌细胞中的表达下调(P＜0.01).过表达miR-195后,Oct4、Sox2和Nanog mRNA表达降低,成球能力和侵袭能力被抑制(P＜0.05或P＜0.01).生物信息学分析预测miR-195候选靶基因为Akt3;Western blot法检测过表达miR-195后的Akt3蛋白表达降低(P＜0.05);而双荧光素酶报告基因实验验证Akt3并非miR-195的直接靶基因.结论 MiR-195可能通过非靶向调节Akt3的方式抑制胃癌干细胞的干性特征和侵袭能力,为胃癌治疗提供了一个潜在靶点.

目的 探讨血清微小核糖核酸-21-3p(miR-21-3p)、IL-18水平对重症急性胰腺炎(SAP)患者急性肾损伤(AKI)的预测价值.方法 选择SAP患者195例,根据住院期间是否发生AKI分为AKI组57例、非AKI组138例.入院次日,采集清晨空腹肘静脉血,离心留取血清,采用实时荧光定量PCR技术检测血清miR-21-3p,采用ELISA法检测血清IL-18.收集所有研究对象基本病历资料(包括性别、年龄、BMI、糖尿病史、高血压史、收缩压、舒张压)、实验室检查资料[空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、胱抑素C(Cys C)]、Ranson评分,采用Logistic回归模型分析SAP患者AKI发生的危险因素.采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清miR-21-3p、IL-18水平对SAP患者AKI发生的预测价值.结果 AKI组血清miR-21-3p、IL-18水平均高于非AKI组(P均<0.05).多因素Logistic回归分析发现,miR-21-3p、IL-18、Scr、BUN、hs-CRP、Cys C、Ranson评分均为SAP患者AKI发生的独立危险因素(P均<0.05).ROC曲线分析显示,血清miR-21-3p、IL-18水平单独和联合预测SAP患者AKI发生的曲线下面积(AUC)分别为0.786、0.769、0.858,血清miR-21-3p、IL-18水平联合预测SAP患者AKI发生的AUC高于二者单独(P均<0.05).结论 血清miR-21-3p、IL-18是SAP患者AKI发生的独立危险因素;血清miR-21-3p、IL-18水平对SAP患者AKI发生均具有一定预测价值,二者联合时预测价值更高.

目的 研究miRNA-195在宫颈癌组织和细胞中的表达,分析其对宫颈癌细胞增殖、迁移的影响和作用机制.方法 检测35例临床宫颈癌组织及其对应癌旁正常组织中miRNA-195,通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析其与宫颈癌患者预后的关系;采用细胞增殖实验和划痕迁移实验验证miRNA-195对宫颈癌siHa,Hela细胞增殖、迁移的影响;通过microRNA数据库预测miRNA-195的靶基因,双荧光素酶基因实验验证靶向结合关系;qRT-PCR验证miRNA-195对靶基因的调控;分析宫颈癌中靶基因的表达作用及与miRNA-195的相关性,通过细胞回补实验验证miRNA-195是否通过靶向调控蛋白表达在宫颈癌中发挥功能.结果 宫颈癌组织中miRNA-195相对表达低于癌旁正常组织(21.03±5.17 vs 40.67±7.92),差异有统计学意义(t=12.285,P<0.001),且具有低表达预后差的临床特征(Logrank P=0.032).过表达miRNA-195抑制了宫颈癌细胞的增殖(t=6.725～21.433,均P<0.01)和迁移速率(t=12.443,16.749,均P<0.001).CCND2和MYB是miRNA-195的靶基因,过表达miRNA-195显著抑制了CCND2和MYB mRNA的蛋白表达(P<0.01).宫颈癌组织中CCND2较癌旁正常组织显著高表达(52.67±4.79 vs 39.86±6.39),差异有统计学意义(t=12.453,P<0.001);MYB较癌旁正常组织显著高表达(43.06±6.43 vs 22.07±6.85),差异有统计学意义(t=13.217,P<0.001);且分别与miRNA-195表达呈负相关(r=-0.726,-0.592,均P<0.05).过表达CCND2和MYB显著促进了宫颈癌细胞的增殖和迁移速率,敲低CCND2和MYB表达则得到与之相反的结果(F=144.947,875.160,均P<0.001);在过表达miRNA-195细胞中分别回补过表达CCND2和MYB后细胞增殖、迁移速率基本回归到正常水平.结论 miRNA-195可通过靶向调控CCND2和MYB表达抑制宫颈癌癌细胞的增殖和迁移,进而参与宫颈癌的发生发展.

目的 研究微小核糖核酸(microRNA,miRNA)基因在骨肉瘤患者外周血中的差异表达.方法 收集郑州大学第一附属医院2013年3月至2015年4月收治的40例股骨远端和胫骨近端骨肉瘤患者,同期选择40例健康体检者.分别收集两组患者空腹静脉血,肿瘤组织及对照组相应部位组织,利用miRNA基因芯片对其进行分析,观察miRNA在外周血及骨肉瘤组织中的差异表达.结果 筛查出骨肉瘤肿瘤组织中相关异常表达基因270个,上调miRNA基因15个,下调miRNA基因255个.上调及下调倍数大于2.5的miRNA 19个,上调大于2.5倍的miRNA基因8个:miR-21、miR-451、miR-218、miR-18a、miR-148a、miR-198、miR-195、miR-497.下调大于2.5倍11个:miR-29、miR-223、miR-183、miR-31、miR-654、miR-495、miR-493、miR-410、miR-409-5p、miR-409-3p、miR-382.外周血中异常表达基因178个,上调19个,下调159个.上调及下调倍数大于2.5的miRNA 21个,上调大于2.5倍的miRNA基因12个:miR-21、miR-451、miR-199a、miR-18a、miR-18b、miR-148a、miR-195、miR-497、miR-130b、miR-182、miR-374a、miR-301b.下调大于2.5倍的有9个:miR-29、miR-223、miR-410、miR-133b、miR-31、miR-206、miR-144、miR-493、miR-142-3p.两组结果有较高的重合性.其中表达特异性最明显的是miR-21(上调),miR-29(下调).结论 骨肉瘤肿瘤组织与外周血在miRNA表达上存在一定程度相关性和一致性,其中miR-21和miR-29特异性最明显,并预测其作为生物学标志物的可能性.