目的:了解山东省兰陵县羊携带志贺毒素基因 stx2k新亚型大肠埃希菌的情况及其分子特征。 方法:2019年11月采集山东省兰陵县不同养殖户的羊粪便512份，经EC肉汤增菌后PCR检测 stx基因，阳性样品分别接种科玛嘉(CHROMagar?)ECC及科玛嘉(CHROMagar?)STEC培养基，对 stx基因阳性菌株进行全基因组测序。根据基因组数据分析菌株 stx基因亚型、血清型、多位点序列分型(MLST)情况及毒力基因携带情况。 结果:从512份羊粪中共分离86株产志贺毒素大肠埃希菌，包括5种不同的 stx亚型，其中 stx2k亚型菌株37株；86株菌分为20种O∶H血清型及18种不同ST型。 结论:山东省兰陵县羊携带的产志贺毒素大肠埃希菌在志贺毒素亚型、血清型及毒力基因等分子特征方面存在多样性，且检出了产志贺毒素2k新亚型的大肠埃希菌。

目的:了解我国不同来源产志贺毒素 stx2e亚型大肠埃希菌分离株的分子特征。 方法:对2012年—2018年间监测中发现的3株人源、13株动物源及8株食品来源的携带 stx2e基因亚型的大肠埃希菌进行体外抗生素敏感性试验并进行全基因组测序。根据全基因组序列，对菌株 stx基因亚型、血清型、多位点序列分型(MLST)、毒力基因及耐药基因携带情况、系统进化关系及志贺毒素前噬菌体基因组成进行分析。 结果:24株菌分为19种O∶H血清型和19种序列(ST)型，均携带至少1种耐药相关基因，其中19株菌至少对一种抗生素耐药。3株人源菌株分别属于不同血清型及ST型，但存在与之相同血清型或ST型的动物、食品来源菌株；全基因组进化分析显示相同血清型或ST型的人源菌株分别与动物或食品源菌株具有较近亲缘关系。不同菌株间 stx2e序列高度相似(>99.7%)，但志贺毒素前噬菌体基因组成、大小等存在较大差异。 结论:本研究为我国对罕见的人源性 stx2e亚型大肠埃希菌菌株特征进行报道，结合动物及食品源性菌株，表明我国 stx2e亚型菌株具有高度遗传多样性，存在感染人的风险。

目的:评价并验证成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）、血清学和多位点测序分型（MLST）方法对大肠埃希菌分型的效果。方法:使用CRISPRsFinder分析大肠埃希菌全基因组序列的CRISPRs间隔序列，使用在线软件SeroTypeFinder和 MLST获得血清型和序列型（ST）；采用PCR扩增并分析349株大肠埃希菌CRISPRs，使用CRISPRs间隔序列预测血清型和ST，并比较血清学和MLST分型结果。结果:将I-E型CRISPR/Cas、I-F型CRISPR/Cas和CRISPR3-4分别命名CT-Ⅰ、CT-Ⅱ和CT-Ⅲ。根据CRISPRs间隔序列构成和排列进一步进行分型，203株大肠埃希菌被分为79个CT型别，76个血清型和66个ST。CRISPRs分型的区分能力最强，辛普森指数为0.936。CRISPRs和血清学的关联程度最高，调整兰德指数为0.908。CRISPRs型能进一步区分相同血清或ST产志贺毒素的大肠埃希菌［O157∶H7（ST11）、O104∶H4（ST678）和O26∶H11（ST21）］菌株。扩增实验室菌株的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3、CRISPR4和CRISPR3-4，检出率分别为81.1%、94.5%、1.4%、1.4%和4.6%；根据CRISPRs间隔序列预测O157∶H7（ST11）和ST131准确率分别为95.0%和100.0%。结论:基于CRISPRs的大肠埃希菌的分子分型方法呈现较好的分型效果和临床应用效果，预期可以成为大肠埃希菌分型的重要分子标志物。

目的 了解致泻性大肠埃希菌(DEC)在急性腹泻患儿(<5岁)中的分布、流行状况以及耐药性.方法 2015年8月1日至2016年9月30日,共收集华中科技大学同济医学院附属同济医院684例急性腹泻患儿的大便标本,培养后分离鉴定常见病原菌,鉴定为大肠埃希菌的菌落用PCR法扩增毒力基因,检测DEC感染情况;所有的致病性大肠埃希菌(EPEC)均同时采用血清凝集法进行血清学鉴定.琼脂稀释法进行药物敏感性试验.结果 共分离到149株致病菌,分离率为21.7％;其中DEC 54株,居第2位,发病高峰在夏秋季.最常见的毒力基因型别是EPEC,占50％(27/54),其中非典型EPEC占77.8％(21/27),典型EPEC占22.2％(6/27);其次是肠聚集性大肠埃希菌20.4％(11/54)和肠产毒性大肠埃希菌14.8％(8/54),肠侵袭性大肠埃希菌和产志贺样毒素大肠埃希菌均为3.7％(2/54),混合型占7.4％(4/54).多重PCR与单重PCR一致性为17/18;27株EPEC菌株,仅有11株(40.7％)血清凝集试验阳性.DEC对一线药物(氨苄西林、复方磺胺甲噁唑)以及头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟的耐药率均超过50％(27/54);耐药率较低的药物有头孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦以及亚胺培南和美罗培南.5株(9.2％)DEC对碳青霉烯类耐药.结论 DEC耐药现象严重,一线药物氨苄西林、复方磺胺甲噁唑可能不再适合DEC感染的经验性治疗.此外,相对高效的碳青霉烯类也出现了耐药.需加强对DEC的流行病学调查和耐药性分析.

目的 探讨小儿大肠埃希菌感染毒力因子检测及耐药性临床研究,以指导临床合理用药.方法 非植入导尿管患者尿标本分离非重复感染大肠埃希菌120株,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)大肠埃希菌毒力因子,包括细胞坏死因子CNF1和CNF2,黏附因子papG和iha,铁载体相关因子fyuA、irp-2和iut,肠侵袭因子Einv,志贺样毒素VT1、VT2及VT2e,Ⅰ型菌毛fimH,其他如traT、aerJ等因子;采用美国临床实验标准化委员会(NCCLS)推荐的纸片扩散法(Kirby-Bauer,K-B法)测定所有毒力因子的耐药性,并分析多药耐药谱的分布率、毒力基因分布与耐药性的关系.结果 所有120株大肠埃希菌临床分离菌株均来源于小儿尿路感染,采用尿液培养获得;毒力基因检出率依次为fimH 90.33％(109/120)、traT 80.83％(97/120)、aerJ 65.00％(78/120)、Einv 60.00％(72/120)、papGⅢ39.17％(47/120)、pAI 30.83％(37/120)、cnf125.83％(31/120)、fyuA 24.17％(29/120)、cnf 220.83％(25/120)、papC 18.33％(22/120)、papG 11.67％(14/120)、hlyA 3.33％(4/120);药敏试验显示,碳青霉烯类(亚胺培南)的敏感性最高,达100％,其次为哌拉西林/他唑巴坦,敏感率为93.33％(112/120),耐药性最高的是青霉素类的氨苄青霉素85.83％(103/120)、左氧氟沙星76.67％(92/120)、复方新诺明67.50％(81/120);耐≥3类的抗菌药物的多药耐药率达54.17％(65/120);毒力因子分布数与耐药性间呈正相关(r=0.019,P<0.05).结论 小儿大肠埃希菌感染涉及的毒力因子较多,临床耐药性严重,且耐药程度与毒力因子分布数密切相关.

我国临床腹泻病人粪便标本中，约有60%检不出任何已知病原，而能分离出几乎纯培养的大肠杆菌。这些大肠杆菌过去被误认为是肠道正常菌群。我们对在北京西城区三个医院从腹泻病患者粪便标本中分离的172株所谓正常大肠杆菌，进行了质粒DNA、Hep-2细胞粘附试验，和10种DNA探针分析。结果发现这些所谓的肠道正常大肠杆菌并不正常，其中44%可鉴定为致泻性大肠杆菌，包括EHEC16株，占所检查菌株的9.3%；EPEC8株，占所检查菌株的4.7%；EAggEC11株占6.4%。还有54株菌对Inv、SLT1或SLT2探针同时呈阳性反应，占所检查菌株的31.4%。我们认为对Inv、SLT1或SLT2探针同时呈阳性反应的菌株是一种尚未在国际上报道的致泻性大肠杆菌，将其命名为“产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌”（Entero-SLTs-producing and invasive E.coli ESIEC）。与EIEC不同，ESIEC虽能侵入Hep-2细胞，但不具有ipaB基因，编码侵袭力的基因与EIEC有所不同。该类菌株虽对Hep-2细胞呈现集聚性粘附现象，但不与肠集聚性大肠杆菌（EAggEC）探针起反应；产生肠毒素，细菌滤过液对Hep-2细胞有致死作用。ESIEC占所检查菌株的31.4%，在我国有可能是一种比ETEC、EIEC、EPEC、EHEC发病率都高的致泻性大肠杆菌。

目的 分析山东省动物粪便中非O157产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的菌株特征及耐药状况.方法 于2015—2016年,采用方便抽样方法在山东省微山县、莱州市共采集1022份新鲜动物粪便标本,共分离到24株非O157 STEC.通过血清凝集实验进行血清分型,采用微量肉汤稀释法进行药物敏感性试验,后采用双纸片协同试验进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测.采用PCR方法检测耐药基因.采用PFGE进行分子分型并采用多位点序列分型(MLST)确定等位基因谱及菌株序列型.使用CLC Sequence Viewer及Conting Express生物信息软件分析不同ST序列群及菌株间的进化关系.结果 24株非O157型STEC菌株中23株来自猪粪,1株来自牛粪;毒力基因均为stx 2型;对磺胺异(恶)唑耐药的菌株较多,为22株,对复方磺胺异(恶)唑和萘啶酸耐药的菌株均为18株,对氯霉素耐药菌株为13株,对四环素耐药菌株为19株.存在多重耐药现象,耐药谱为:磺胺异(恶)唑-四环素-复方磺胺异(恶)唑-萘啶酸-氯霉素,对头孢吡肟和亚胺培南均为敏感.ESBLs确证实验表明,有4株非O157型STEC产ESBLs.PCR检测7种耐药基因,4种四环素类耐药基因(tetA、tetB、tetC、tetD)均有检出, ESBLs类耐药基因(blaSHV-1、bla CTX-M、bla TEM)均为阴性.24株菌分成15个PFGE型别,其聚类结果比较分散,无优势PFGE型别.MLST型别有11种,其中ST540、ST5133型别的菌株最多,各为4株菌,聚类为1个MLST基因组.结论 山东省部分地区在动物粪便中检出的非O157 STEC血清型比较分散,对常见的抗生素耐药率比较高,具有明显的分子多态性,应重点加强对这类菌株的监测和管理.

目的 研究产志贺毒素大肠埃希氏菌(STEC)国际标准检测方法中前增菌肉汤中抗生素种类和浓度对STEC分离的影响.方法 利用STEC和其他非STEC菌株,对国际现行检测STEC标准方法推荐的在前增菌步骤使用3种抗生素的最低抑菌浓度(MICs)进行测定.结果 不同抗生素对STEC抑制存在差异性.在推荐浓度下,吖啶黄及头孢磺啶会抑制stx1a和stx2b亚型STEC的生长,新生霉素则会抑制stx1a、stx1c、stx1d、stx2b、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g等亚型菌株的生长.此外,STEC与其他革兰氏阴性菌对吖啶黄、头孢磺啶、新生霉素的MICs无显著性差异(P＜0.05).而革兰氏阳性菌对这3种抗生素的MIC值显著低于革兰氏阴性菌(P＜0.01).结论 本文结果为STEC增菌方法的研发完善提供了有价值的证据.