目的:探讨卵巢上皮性癌（卵巢癌）患者腹水来源的外泌体对卵巢癌干细胞样细胞（OCS-LC）干性特征及侵袭能力的影响。方法:（1）采用无血清悬浮培养法诱导卵巢癌细胞系A2780细胞生成OCS-LC，并采用成球实验、分化功能实验以及流式细胞仪检测等方法鉴定OCS-LC的成球克隆生长、定向分化潜能、干性标志物CD 133表达等干性特征。（2）采用超速离心法提取卵巢癌来源外泌体（OCDE），包括卵巢癌患者腹水来源及A2780细胞来源的外泌体［即腹水来源外泌体（ADE）及细胞来源外泌体（CDE）］，采用透射电镜观察外泌体形态、纳米颗粒跟踪分析（NTA）法测量外泌体粒径、蛋白印迹（western blot）法检测特异性蛋白分子热休克蛋白70（HSP-70）、CD 63、CD 9的表达等方法对外泌体ADE和CDE进行鉴定。（3）将ADE和CDE分别与OCS-LC共培养，即ADE+OCS-LC组、CDE+OCS-LC组，以磷酸盐缓冲液（PBS）与OCS-LC共培养作为空白对照组。通过观察3组OCS-LC的成球周期、最大球直径及成球率，评估各组OCS-LC的成球能力；采用免疫荧光染色法检测3组OCS-LC的干性标志物CD 133的表达；实时荧光定量PCR技术检测3组OCS-LC中干细胞转录因子八聚体结合转录因子4（Oct-4）和Nanog mRNA的表达；穿膜小室（transwell小室）实验检测3组OCS-LC的侵袭能力。 结果:（1）OCS-LC的鉴定：成球实验显示，OCS-LC单细胞悬液在无血清培养基中可二次成球生长；分化功能实验显示，OCS-LC细胞球在含血清培养基中改变生长方式，分化成呈贴壁生长的A2780细胞；流式细胞仪检测显示，OCS-LC中CD 133阳性（ CD133+）细胞的比例为（18.9±0.9）%，显著高于其对照（即A2780细胞）的（0.6±0.5）%（ t=38.570， P<0.01）。（2）OCDE的鉴定：透射电镜下观察，外泌体ADE和CDE均可见清晰的脂质双层膜结构，一侧呈凹陷的半球形或杯托样；NTA法测量显示，外泌体粒径主要在30~100 nm范围，平均粒径67.2 nm；western blot法检测显示，特异性蛋白分子HSP-70、CD 63、CD 9均呈阳性表达。（3）共培养后，成球实验显示，空白对照组、ADE+OCS-LC组、CDE+OCS-LC组OCS-LC均可继续成球生长，其中ADE+OCS-LC组细胞呈现两种生长方式，大部分细胞继续维持干性成球生长，小部分细胞出现分化，呈贴壁生长；3组OCS-LC的成球周期分别为（15.3±1.5）、（10.3±0.6）、（6.7±0.6） d，细胞球最大直径分别为（100.3±3.2）、（145.2±5.1）和（170.0±2.1） μm，成球率分别为（1.05±0.20）%、（4.15±0.10）%和（10.45±0.25）%，3组分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05），且CDE+OCS-LC组分别与ADE+OCS-LC组比较，差异也均有统计学意义（ P均<0.05）。免疫荧光染色法检测显示，空白对照组、ADE+OCS-LC组，CDE+OCS-LC组OCS-LC细胞球中呈绿色荧光的 CD133+细胞数依次增多，3组OCS-LC细胞球中 CD133+细胞比例［分别为（26.6±1.5）%、（46.2±2.1）%和（58.4±2.2）%］比较，差异有统计学意义（ F=187.588， P<0.05），且CDE+OCS-LC组较ADE+OCS-LC组更高（ t=6.753， P<0.05）。实时荧光定量PCR技术检测显示，空白对照组、ADE+OCS-LC组、CDE+OCS-LC组OCS-LC中Oct-4 mRNA的表达水平分别为1.04±0.12、3.46±0.24、4.03±0.31，Nanog mRNA表达水平分别为1.00±0.07、1.57±0.32、2.66±0.15，3组分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05），且CDE+OCS-LC组均显著高于ADE+OCS-LC组（ P均<0.05）。transwell小室实验显示，空白对照组、ADE+OCS-LC组、CDE+OCS-LC组的侵袭细胞数依次增多，分别为（30±5）、（102±4）、（210±7）个，3组比较，差异有统计学意义（ F=820.800， P<0.05），且CDE+OCS-LC组显著高于ADE+OCS-LC组（ t=23.202， P<0.05）。 结论:卵巢癌ADE能够增强和维持OCS-LC的干性特征，促进肿瘤细胞的侵袭转移，但CDE优于ADE。

目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养,建立悬浮细胞系,并进行检定,以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础.方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞,命名为MDCK-S细胞,进行18S及物种特异性PCR鉴定.将MDCK-S细胞传代至33代,作为主代细胞库(master cell bank,MCB);传代至38代,作为工作细胞库(working cell bank,WCB).MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测.结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞,且未发现突变、缺失等情况,无其他种属DNA污染.MCB及WCB细胞生长状态良好,生长曲线呈"S"型,倍增时间分别为27.78及27.21h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;细胞形态、结构及细胞膜完整,膜上微绒毛较多,表明细胞状态好,不同细胞代次之间差异较小;具有成瘤性,但不具有致瘤性;染色体2 n=(78±2)条占比为86％～96.19％,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定;对流感病毒较敏感.结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养,并建立了悬浮细胞系MDCK-S.本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础.

目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究.方法 采用无血清培养和"摇床适应法"对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测.结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在 24～72 h,平台期在 108～144 h之间,衰退期在 144 h以后,细胞 PDT为 36 h,细胞密度在14.01～14.88×108 个/L之间,细胞平均圆度在 0.73～0.75 之间,细胞直径在 12.12～14.44 μm之间.Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感.结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长.STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别.为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究.

诱导多能干细胞(iPSC)是通过导入外源基因或在培养基中加入化学物质等方法使体细胞去分化而获得.与胚胎干细胞类似,iPSC可以分化形成三种胚层细胞系.iPSC能通过二维分化方法(如单层细胞培养和共培养),或拟胚体诱导法和基于支架的三维细胞培养方法分化为心肌细胞.iPSC分化成心肌细胞的过程还需通过激活或抑制特定的信号通路(如Wnt、BMP、Notch信号通路)来模拟体内心脏发育过程.近年来,通过生物反应器进行细胞悬浮培养,已能产生足够数量的iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CM).iPSC-CM在移植前需要通过代谢调节和细胞分选等方法进行纯化,以消除可能导致畸胎瘤形成的未分化iPSC.目前,iPSC-CM的主要移植方法为细胞悬液注射和细胞片移植.动物实验研究表明,将iPSC-CM移植到梗死心肌中能改善心脏功能.本文综述了上述关于iPSC-CM治疗急性心肌梗死的临床前相关研究,并讨论了iPSC-CM在临床应用中的局限性和挑战,以期为iPSC-CM的临床转化研究提供参考.

目的:建立海南地区引种温郁金Curcuma wenyujin的悬浮细胞系,并初步研究离体培养材料中挥发性成分的积累.方法:甄选诱导愈伤组织的外植体、培养基以及悬浮细胞起始愈伤组织等,建立稳定的悬浮细胞系;采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定温郁金悬浮细胞团等离体培养材料中莪术挥发油等挥发性成分.结果:嫩根诱导的愈伤组织是建立稳定悬浮细胞系的适宜起始材料;愈伤组织继代培养2次后增殖较明显,可形成颜色鲜黄、颗粒均一、疏松易碎的胚性愈伤组织;三种离体培养材料中,常见挥发性物质总量检出率依次为组培苗、悬浮细胞团、愈伤组织;莪术挥发油中常见化学成分牻牛儿酮、莪术烯、莪术二酮、榄香烯等总量的检出率依次为组培苗、愈伤组织、悬浮细胞团.结论:海南地区引种温郁金悬浮细胞系等离体培养材料均积累了一定量的莪术油等挥发性有效成分,为进一步筛选优化培养体系、促进培养物次生代谢物的积累提供了基础研究.

目的:通过无血清悬浮球状培养方法富集纯化人源前列腺癌干细胞并进行小鼠体内外实验验证.方法:采用前列腺癌DU145细胞系,通过无血清悬浮球状培养的方法分离富集、培养纯化出肿瘤干细胞微球(Tumor spheres).通过流式细胞仪鉴定干细胞表型,并采用动物成瘤实验,将不同数量级的DU145细胞和Tumor spheres细胞接种到NOD/SCID小鼠双侧腋下,观察成瘤率和成瘤速度.对分离富集、培养纯化的Tumor spheres进行诱导分化、增殖水平、活性氧簇、细胞周期检测.为进一步明确Tumor spheres的肿瘤干细胞特性,采用Western blot法检测特异性蛋白的表达,RT-PCR法检测相关mRNA表达.结果:采用无血清悬浮球状培养的方法可使对数生长期DU145细胞分离富集形成Tumor spheres,培养3代可达到纯化的目的,流式细胞技术鉴定其表达前列腺癌干细胞表型CD44(+)CD24(-/low)比例为(63±1)％,明显高于DU145细胞[(33±4)％](P＜0.05).动物成瘤实验显示,接种Tumor spheres侧肿瘤成瘤速度和成瘤率均高于接种DU145细胞侧.Tumor spheres具有更强的自我更新能力和分化潜能,细胞周期检测发现Tumor spheres中(81.67±0.68)％处于细胞周期的G0/G1期(P＜0.05),同时Tumor spheres具有更低水平的活性氧簇ROS水平(P＜0.05).Tumor spheres高表达肿瘤干细胞HES1蛋白(P＜0.05),Tumor spheres高表达肿瘤干细胞相关Notch1、HES1、HIF-1α、Sox2、Jagged1的mRNA(P＜0.05).结论:无血清悬浮球培养分离纯化DU145肿瘤干细胞的方法简便易行、获取量大、成瘤率高,Tumor spheres具有明确的肿瘤干细胞特性,可作为前列腺癌肿瘤干细胞研究的良好实验模型.

本文研究了中药蜂胶胶囊主要活性成分白杨素对人肝癌细胞系SMMC-7721肝癌干样细胞(liver cancer stem-like cells,LCSLCs)球形成抑制作用及其机制.采用干细胞条件培养基悬浮培养SMMC-7721细胞得到第3代球细胞定义为(SFCs).通过球形成试验评价白杨素对SFCs球形成率的影响,Westem blot分析白杨素处理SFCs的CD133、CD44、CK2α和Gli1蛋白表达水平,CK2α siRNA转染SFCs探讨白杨素的作用机制.结果表明不同浓度白杨素降低SFCs球形成率,下调CD133、CD44、CK2α和Gli1蛋白表达.与乱序对照siRNA转染细胞相比,CK2αsiRNA转染下调CK2α和Gli1蛋白表达,同时,协作增强白杨素抑制CK2α和Gli1蛋白表达作用.说明白杨素可能通过抑制CK2α表达阻断Hedgehog信号转导从而抑制SFCs球形成.

目的:建立致心律失常性右室心肌病(ARVC)患者特异性的诱导性多能干细胞(iPSCs),为研究ARVC发病机制提供研究模型.方法:培养来源于ARVC患者皮肤成纤维细胞,并进行突变位点测序鉴定.通过仙台病毒转导入外源性多能转录因子,将ARVC患者皮肤细胞诱导为iPSCs,结合免疫荧光法,实时荧光定量PCR,以及体内外三胚层形成实验对iPS细胞全能型进行鉴定.通过调控Wnt信号通路诱导iPS细胞定向分化为心肌细胞.结果:ARVC患者来源的iPSCs显示碱性磷酸酶阳性,多能性相关基因高表达,胚胎干细胞标志物Oct4,SSEA4,TRA-1-81阳性.体外悬浮培养形成的拟胚体以及体内畸胎瘤形成实验均显示ARVC-iPSCs具有向3个胚层分化能力.经过体外心肌定向,ARVC-iPSC可诱导产生自主节律性搏动细胞团,免疫荧光显示cTnT阳性.结论:本研究使用仙台病毒,建立了无插入型ARVC患者特异的诱导性多能干细胞系,该细胞系具有多能分化特性,并可定向分化为心肌细胞,为研究ARVC的致病因素和药物筛选提供宝贵的实验模型.

目的 探讨Snail转录因子与ER-α36介导的雌激素信号在胃癌肿瘤细胞中的成球作用.方法 应用无血清的培养液DMEM/F12悬浮培养胃癌细胞系SGC7901及SGC7901/ER-α36重组细胞系High36和Low36.测定肿瘤细胞球体中Snail+细胞的含量,运用Western blot检测技术鉴定Snail和相关蛋白在肿瘤细胞球体中的表达.给予不同浓度的雌激素刺激,观察不同浓度雌激素对肿瘤细胞球体的影响,检测雌激素处理后Snail蛋白的表达等.结果 超低吸附培养皿无血清悬浮培养肿瘤微球体的效果优于普通培养皿,大约培养1周可形成肿瘤细胞球体,且形成的数量最多,这些肿瘤细胞球体中的细胞可以稳定传代继续形成新的微球体,同时,Snail+细胞含量升高,并且其蛋白在肿瘤细胞球体中的表达增高.ER-α36高表达的High36细胞系经无血清悬浮培养1周后形成的肿瘤微球体数增加.0.1 μmol浓度的ER刺激胃癌细胞株细胞,可以诱导Snail、ER-α36表达上调,而1 μmol浓度的ER刺激却作用相反(P﹤0.05).结论 低浓度的ER可以诱导胃癌细胞株细胞Snail转录因子与ER-α36高表达,Snail转录因子与ER-α36高表达与肿瘤细胞的成球作用关系密切.

目的 从小鼠Lewis肺癌细胞中分离建立非对称分裂细胞系,并初步鉴定其干性特征,为研究非对称分裂在癌症生物学中的作用奠定基础.方法 通过8次连续悬浮聚球,随后5次单细胞克隆的方法,从小鼠Lewis肺癌细胞亲代细胞(LLC-parental cells)中得到非对称分裂细胞系(LLC-ASD cells);通过Brdu标记的免疫荧光实验检测LLC-ASD cells中细胞非对称分裂;进行RT-qPCR、克隆斑成斑实验、单细胞琼脂球形成实验、单细胞克隆形成实验对比两细胞系干性特征;并通过同种小鼠肺部移植成瘤实验和裸鼠皮下成瘤实验分别对比两种细胞系体内转移和成瘤能力.结果 LLC-ASD cells的非对称分裂比例达50%.LLC-ASD cells的克隆斑、悬浮球形成数量和单细胞克隆形成率均分别高于LLC-parental cells(P<0.05),LLC-ASD cells原位种植转移能力较LLC-parental cells明显增强, LLC-ASD cells的裸鼠皮下接种致瘤能力也高于LLC-parental cells(P<0.05).结论 成功建立了小鼠Lewis肺癌细胞非对称分裂细胞系(LLC-ASD cells),并且它表现出了一定干性特征,为研究非对称分裂在肿瘤中的作用奠定了基础.