目的 将贴壁培养的Vero细胞驯化成悬浮培养细胞,并对其生物学特性进行研究.方法 采用无血清培养和"摇床适应法"对细胞进行培养优化,对其进行成瘤性、短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析、透射电子显微镜形态,以及对流感病毒敏感性检测.结果 成功建立悬浮细胞系Vero-S,Vero-S细胞生长期在 24～72 h,平台期在 108～144 h之间,衰退期在 144 h以后,细胞 PDT为 36 h,细胞密度在14.01～14.88×108 个/L之间,细胞平均圆度在 0.73～0.75 之间,细胞直径在 12.12～14.44 μm之间.Vero-S细胞在裸鼠皮下形成肿瘤,而悬浮培养前的Vero细胞不具有成瘤性;STR显示为猴源细胞系;电镜下细胞结构完整;Vero-S细胞对流感病毒感染不敏感.结论 悬浮细胞系Vero-S细胞的生长经历与贴壁细胞类似的生长期、平台期、衰退期,且细胞大小均一,建立的悬浮培养基能够支持Vero-S细胞高密度生长.STR结果表明悬浮Vero细胞具有完全的遗传稳定性,透射电镜下与贴壁Vero细胞无明显区别.为细胞悬浮驯化培养技术提供参考价值,并可用于细胞致肿瘤的机理研究.

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段.MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产.随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术.通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性.总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具.同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性.

通过目的基因的随机整合方式, 构建得到的CHO表达细胞系, 常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域, 而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象, 这主要是由于位点效应所导致的.为了解决这个问题, 现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组, 将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域, 以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定.利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因) 定点整合细胞系; Western blot结果显示, 细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下, 两株细胞系在第3、12、23、35、50代, 细胞每日表达的HSA质量接近, 且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系, 经悬浮驯化后, 在批次条件培养下, 第1、25、50代的悬浮细胞, 在摇瓶内的表达浓度均稳定在13～14mg/L.显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后, 重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性.

传统上从鸡胚中分离病毒用于疫苗的生产常常不能满足需求,研究从体外培养的细胞中分离病毒的途径成为当前疫苗生产领域的迫切需要.本研究利用体细胞诱导重编程技术建立永生化细胞系,为应用于疫苗制备等研究和生产奠定基础.通过慢病毒载体转染转录调控因子(NANOG,LIN28和C-MYC)重编程鸡成纤维细胞,并稳定培养至100代,获得永生化的细胞,而后逐步去除细胞因子、血清等添加物,优化细胞系培养体系,并对细胞驯化实现悬浮生长,以获得单位体积最大密度的细胞.研究结果表明:通过转基因将NANOG,LIN28和C-MYC 3个因子整合入细胞中表达,细胞系对碱性磷酸酶染色呈阳性反应,端粒逆转录酶(cTERT)基因在细胞系中显著上调,并稳定培养至100代,使得这些细胞具有自我更新特性和永生化的潜能.确定了培养基中的血清替代物KSR浓度为20％,并撤除了培养基中bFGF等生长因子,为细胞大规模培养应用提供了可能.永生细胞实现悬浮生长,细胞生长倍增时间为21.71 h,最大密度为1.3×106 cells/mL.因此,我们通过重编程技术建立了一株稳定的永生化细胞系,并且使它能在低浓度KSR中悬浮培养,这为疫苗制备等研究和生产提供科学依据.