成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。

目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

目的:基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性，建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检测技术。方法:参照新型冠状病毒的基因序列，利用生信技术筛选并设计合成多个新型冠状病毒特异的crRNA（CRISPR RNA），以体外转录的通用ssRNA（单链RNA）靶标建立检测技术并优化检测体系，以新型冠状病毒假病毒核酸标准物来评价方法检测限。收集临床样本，其中阳性样本应包含不同的新型冠状病毒变异株，阴性样本包括其他的常见呼吸道病原体（甲型流感病毒/乙型流感病毒、人类副流感病毒、肺炎克雷伯菌等）临床样本。分别用实时荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR及本研究建立的免扩增可视化快速检测技术，对各种样本进行检测，分析评价新建立技术的灵敏度和特异度。采用四格表确切概率法针对荧光定量PCR、数字PCR与本技术检测结果进行统计学分析，采用双侧检验， P<0.01为差异有统计学意义。 结果:本研究设计合成了10条crRNA，用于基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术的建立与优化，本技术可在最短6 min内检出新型冠状病毒的核酸。利用新型冠状病毒假病毒核酸标准物评价该技术的检测限，结果显示仪器辅助下本技术检测限为14拷贝/μl，肉眼下检测限为28拷贝/μl。以qPCR和数字PCR确认的113份临床样本对所建立的检测技术进行敏感度和特异度分析，利用相关公式及SPSS22软件计算分析，该检测技术的敏感度98.5%（66/67），特异度100%（46/46），本研究建立的基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒免扩增可视化快速检测技术检测结果与金标准qPCR检测结果差异无统计学意义（ P=1）。 结论:本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术，该技术流程简单、操作便捷，对操作环境要求低，检测限接近qPCR，有较强的现场检测应用潜力。

目的:建立基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）-规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas13a）准确检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）型碳青霉烯酶基因的方法。方法:收集2020—2021年北京市垂杨柳医院保存的25株产耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）临床分离株和5株碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（CSKP），提取菌株总DNA。设计检测KPC DNA特异性RAA引物和检测CRISPR RNA（crRNA），建立基于RAA-CRISPR-Cas13a技术快速准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。通过KPC质粒和临床样本菌株对方法进行评价，同时使用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）方法进行检测，比较2种方法的检出率和一致性。结果:本研究建立的RAA-CRISPR-Cas13a方法检测KPC质粒和样本的检测灵敏度均可达到1拷贝/μl，高于qPCR（10 1 拷贝/μl）。RAA-CRISPR-Cas13a检测方法和qPCR方法均从30株临床菌株（包含25株CRKP菌株和5株CSKP菌株）中检出23株携带KPC基因，7株未检出KPC基因，25株CRKP菌株中KPC基因检出率为92%（23/25），2种检测方法阳性符合率为100%（23/23）。 结论:将RAA扩增技术结合CRISPR-Cas13a技术，建立了一种准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。该方法有助于精准的筛选产KPC型碳青霉烯酶的菌株。

目的 探讨并建立非专业实验室场景下恒温、快速及简便的检测副溶血性弧菌的方法.方法 本研究针对副溶血性弧菌toxR基因设计特异性引物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA),建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas13a)的反应体系,采用自配十二烷基硫酸钠(SDS)核酸快速提取试剂提取样本全基因组,并结合荧光法实现检测结果的可视化判读.结果 利用副溶血性弧菌菌株ATCC 17802和其他3种非副溶血性弧菌(溶藻弧菌、河流弧菌和梅氏弧菌)以及3种临床上常见腹泻致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)对RPA-CRISPR/Cas13a荧光法的特异性进行验证,结果显示特异性为100.00％;对副溶血性弧菌基因组DNA进行倍比稀释并检测,该方法最低检出限为102 copies/μl.最后,将建立的方法应用于野生型副溶血性弧菌检测,检测结果与TaqMan定量聚合酶链式反应(TaqMan-qPCR)检测结果及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定结果一致.结论 本研究建立了一种针对toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法,具有简便、快速、特异性强、结果判读可视化等优点,为非专业实验室场景下的副溶血性弧菌快速检测提供了较好工具.

规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统已作为近年来兴起的新一代分子诊断工具,被广泛应用于基因编辑、核酸检测等领域,其中Cas13a亚型因其在核酸检测中高特异度、高灵敏度、无需昂贵设备、操作简单、费用低廉等特点,在病原体检测领域展现出巨大的潜力.该文综述了 CRISPR-Cas13a的作用机制、在病原体检测中的应用以及相关检测方法,并对Cas13a应用前景进行了展望.以期为CRISPR-Cas13a系统的进一步研究及其在病原体检测中的应用提供借鉴和参考.

目的 将重组酶介导的扩增(RAA)技术与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas 13a)检测系统相结合,建立一种快速、灵敏、特异的副溶血性弧菌检测方法(RAA-Cas13a).方法 样本DNA经RAA扩增后,产物采用CRISPR-Cas13a检测系统进行检测,比较CRISPR-Cas13a与琼脂糖凝胶电泳对RAA产物的检测敏感性.对方法进行灵敏度与特异度测试,通过临床样本检测比较建立的方法与real-time PCR法的一致性.结果 CRISPR-Cas13a对RAA产物的检测敏感性高于琼脂糖凝胶电泳法;建立的RAA-Cas13a方法检测副溶血性弧菌的灵敏度为10拷贝DNA分子/反应,与其他病原体之间无交叉反应,与real-time PCR对临床样本的检测阳性率差异无统计学意义(P＞0.05),二者的检测一致性较高(kappa=0.934).结论 建立的RAA-Cas13a方法具有快速简单、灵敏特异等优点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了新的工具.

目的 基于CRISPR-Cas13a附带切割荧光检测原理,建立H7亚型禽流感病毒无扩增直接检测方法.方法 从GenBank下载700余条H7亚型禽流感病毒的HA基因核酸序列,比对后针对保守区片段序列确定病毒模板,筛选最佳crRNA并对CRISPR-Cas13a蛋白、H7-crRNA及荧光双标记探针等反应条件进行优化.结果 在优化的反应条件下,60 min内检测敏感度可达100pmol/L模板ssRNA.特异性良好,与甲型H1N1、H3N2、H9N2流感病毒,以及乙型流感病毒和新城疫病毒疫苗株RNA无交叉反应.结论 建立了针对H7亚型禽流感病毒的无需核酸扩增,直接进行CRISPR-Cas13a附带切割荧光检测的方法,可快速、准确和低成本地即时即地检测.

目的:建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）检测方法。方法:提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后，使用Hind Ⅲ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶（PSAD）分别进行酶切；根据松弛环状DNA（rcDNA）和cccDNA的结构差异，设计特异性扩增HBV cccDNA的引物，对酶切后的产物进行滚环扩增（RCA）和PCR扩增；并筛选crRNA，建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果:利用α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）和HBV表面抗原（HBsAg）引物对双重酶切后的产物进行扩增，验证产物中HBV基因组的存在；利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增，验证了产物中只存在HBV cccDNA；利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释，然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测，计算出检测下限为10拷贝/μl。结论:本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法，可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测，为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。