[目的]为明确几丁质和鞭毛蛋白衍生肽flg22诱导的辣椒幼苗先天免疫生理响应特征,探讨辣椒先天免疫生理响应与辣椒抗多种病害的关系.[方法]以5个四川本地辣椒品种幼苗为试材,鉴定它们对青枯病和疫病病情指数和抗性水平,采用水培法培育幼苗并进行外源几丁质和flg22处理,检测各品种不同诱导时间下幼苗根系生长、气孔孔径、胼胝质沉积、活性氧(ROS)积累和SOD、CAT活性,以及先天免疫相关基因表达量的变化,综合评价其生理响应及其与抗病性关系.[结果](1)各品种幼苗青枯病和疫病病情指数以'川腾10号'最低,抗病性最强,以'本地条椒'最高,抗病性最弱.(2)外源几丁质和flg22抑制了各品种幼苗根系生长速率,诱导离体叶片气孔闭合,促进叶片细胞壁胼胝质沉积加厚,ROS含量持续增加,SOD和CAT活性不断提高.各品种幼苗先天免疫生理响应指标的平均隶属函数值以'川腾10号'最高,'本地条椒'最低,并且平均隶属函数值与疫病、青枯病病情指数均具有显著负相关性.(3)外源flg22和几丁质诱导'川腾10号'幼苗先天免疫相关基因CaWRKY22、CaMAPK7和ChiIV3显著上调表达.[结论]外源flg22和几丁质可诱导辣椒幼苗先天免疫生理响应,且响应程度强弱在品种间存在差异,依据生理响应指标通过隶属函数可综合评价辣椒品种的抗病水平;'川腾10号'的平均隶属函数值最高,多抗性水平最好,这与其先天免疫相关基因CaWRKY22、CaMAPK7和ChiIV3的显著上调表达有关.

[目的]为增强不结球白菜对芜菁花叶病素养(TuMV)的抗性,研究探讨了不结球白菜中BcCHC1蛋白与TuMV之间的相互作用机制.[方法]首先从不结球白菜中鉴定出重链网格蛋白(CHC)基因家族的成员BcCHCs,随后克隆了 1个代表性的CHC1基因,并对其进行了亚细胞定位分析.通过双分子荧光互补实验(BiFC)筛选出与BcCHC1蛋白相互作用的TuMV蛋白,并利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)来沉默BcCHC1基因,以评估其功能.[结果](1)成功克隆了不结球白菜的BcCHC1基因,该基因的编码序列长5 124碱基对,编码1 708个氨基酸.(2)在TuMV感染不结球白菜30 d后,实时荧光定量PCR分析显示,感染TuMV的不结球白菜中BcCHC1基因的表达量显著降低.(3)亚细胞定位研究表明,BcCHC1蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞膜和细胞核.(4)BiFC实验进一步证实,BcCHC1蛋白能够与TuMV的CI和6K2蛋白发生相互作用,其中与CI的互作主要发生在细胞核内,而与6K2的互作则主要位于细胞膜.(5)通过对BcCHC1基因沉默株系的观察发现,沉默Bc-CHC1基因会导致植株死亡.[结论]BcCHC1蛋白通过与TuMV的CI和6K2蛋白相互作用,影响网格蛋白依赖的内吞作用途径及病毒复制,从而调控TuMV对不结球白菜的侵染.然而,BcCHC1基因调控TuMV侵染不结球白菜的具体机制仍需进一步研究.

目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:体外构建鼻咽癌放射抵抗细胞株，为进一步研究鼻咽癌放射抵抗的分子机制提供实验基础。方法:采用剂量梯度法照射诱导建立放射抵抗细胞模型5-8F-IR。光学显微镜观察细胞形态变化；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；CCK-8实验检测细胞活力；5-溴-2-脱氧尿嘧啶（EdU）实验检测细胞增殖能力；彗星实验及免疫荧光实验检测细胞DNA损伤修复能力；流式细胞术检测细胞凋亡水平及周期分布；蛋白质印迹法检测DNA损伤相关蛋白γH2AX及凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3（Caspase-3）的蛋白表达水平。结果:剂量梯度照射后5-8F-IR细胞形态较亲本5-8F细胞形态变长，5-8F-IR细胞的克隆形成能力（ P<0.01）、细胞活力（ P<0.001）、细胞增殖能力（ P<0.05）、DNA损伤修复能力（ P<0.05）均明显优于亲本细胞5-8F，照射后5-8F-IR细胞的凋亡率明显低于5-8F细胞（ P<0.01），未接受照射时5-8F-IR细胞处于S期的百分比较5-8F细胞升高，接受照射后5-8F-IR细胞出现明显的G 2/M期阻滞（ P<0.01），同时照射后5-8F-IR细胞的DNA损伤相关蛋白γH2AX（ P<0.001）及凋亡相关蛋白Caspase-3（ P<0.05）蛋白表达水平明显低于5-8F细胞。 结论:人鼻咽癌细胞株5-8F经剂量梯度法照射诱导建立的5-8F-IR细胞具有放射抗拒性并显示出与亲代5-8F细胞不同的生物学特性，为探索鼻咽癌放射抵抗机制提供了研究工具。

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法:对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在 hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。 结果:H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。结论:成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。

目的:对临床血液标本分离的细菌7712(＝CGMCC 1.17031＝NBRC 113783＝KCTC 15766)进行生物学特性和系统进化分析，明确其分类学地位。方法:观察菌株的培养特性并进行形态学、生理生化鉴定、基质辅助激光解吸电离子飞行时间质谱鉴定和基因组测序鉴定，并构建基因组发育树以分析其分类学位置。采用在线毒力基因数据库和抗生素抗性数据库，分别对分离株及近缘菌株进行基于全基因组的毒力基因和耐药基因的比较分析。结果:分离株7712为脲酶阳性的需氧革兰阴性非发酵菌，VITEK GN鉴定为人苍白杆菌。16S rRNA基因序列分析显示，分离株7712与苍白杆菌属及布鲁菌属均具有较高的序列一致性；而基于全基因系统发育分析显示，分离株7712与油葫芦苍白杆菌LCB8 T和嗜血苍白杆菌CCUG 38531 T聚类成一个分支，并与其他苍白杆菌属细菌和布鲁菌属聚类成一个大的分支。基因组亲缘性指数分析显示，分离株7712和油葫芦苍白杆菌LCB8 T的平均核苷酸一致性为98.22%，高于原核生物物种的鉴定阈值95%。分离株7712携带多种毒力基因和耐药基因，其中 OCH基因可能与头孢菌素耐药有关。 结论:确定了1例由油葫芦苍白杆菌引起的临床感染，丰富了苍白杆菌属生物多样性信息。

目的:构建乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis，LL）介导的多房棘球绦虫EmⅡ/3疫苗，并探讨其表达效率。 方法:以pCD-EmⅡ/3质粒为模板扩增EmⅡ/3基因，采用 XbaⅠ和 HindⅢ双酶切后插入pMG36e质粒，构建重组质粒pMG36e-EmⅡ/3，转化大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定；电穿孔转化LL MG1363株，构建多房棘球绦虫重组（r）LL-EmⅡ/3疫苗。对rLL菌株进行罗红霉素抗性筛选后，抽提质粒进行PCR鉴定，并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）进行表达鉴定。 结果:pMG36e-EmⅡ/3重组质粒双酶切鉴定，出现大小约3 600 bp的载体条带和1 759 bp的EmⅡ/3基因条带。以具有罗红霉素抗性的rLL菌株中抽提的质粒为模板，PCR可扩增出大小为1 759 bp的EmⅡ/3基因；SDS-PAGE显示，rLL-EmⅡ/3疫苗可表达相对分子质量为66 × 10 3的EmⅡ/3蛋白，培养3 d的表达蛋白约占菌体总蛋白的20%；Western blot显示，表达蛋白可被泡型棘球蚴感染的鼠血清识别。 结论:成功构建多房棘球绦虫rLL-EmⅡ/3疫苗，其表达的EmⅡ/3蛋白具有特异的抗原性。

目的:研究多重耐药霍氏肠杆菌霍夫曼亚种临床分离株C37携带 blaNDM-1基因质粒的遗传特征，并对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的核心基因组进行系统发育分析，以研究霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的全球流行情况。 方法:收集2014年8月至2021年8月中山大学附属第一医院分离的耐碳青霉烯阴沟肠杆菌复合物（CRECC）。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）和16S rRNA Sanger测序对C37进行菌种鉴定。使用微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性试验。采用聚合酶链反应（PCR）检测C37菌株携带的β内酰胺酶耐药基因和质粒介导的喹诺酮类耐药（PMQR）基因。使用接合试验确认C37菌株抗性基因的接合转移性。对C37菌株进行全基因组测序，提取霍氏肠杆菌霍夫曼亚种的核心基因组，对目前可公开获得的66个霍氏肠杆菌霍夫曼亚种进行系统发育分析。结果:霍氏肠杆菌霍夫曼亚种C37菌株对三代头孢、碳青霉烯类、氨基糖苷类及喹诺酮类抗菌药物耐药，携带 blaACT-5、 blaNDM-1、 qnrA1、 aac（ 6′） -Ib-cr、 oqxAB、 fosA、 dfrA15等多种抗性基因及IncX3、IncX4、IncFIB和IncFII质粒。多位点序列分型（MLST）分析显示其属于阴沟肠杆菌复合体（ECC）ST78型。系统发育分析显示ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因传播密切相关。 结论:ST78型霍氏肠杆菌霍夫曼亚种与碳青霉烯耐药基因传播密切相关，是传播碳青霉烯耐药基因的高风险克隆，需密切监测其流行情况。

目的:观察6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的去甲肾上腺素释放对小鼠肠道内大肠杆菌细菌移位的影响。方法:选取大肠杆菌野生菌株BW25113和大肠杆菌密度感应调节子C(qseC)基因缺失菌株BW25113ΔqseC，并对其进行聚合酶链反应(PCR)鉴定。将30只ICR小鼠采用随机数字表法分为5组：空白＋sham组、BW25113＋sham组、ΔqseC＋sham组、BW25113＋6-OHDA组、ΔqseC＋6-OHDA组。给每组小鼠灌饲相应的大肠杆菌菌液后(空白组灌饲生理盐水)，6-OHDA组小鼠腹腔内注射6-OHDA建立去甲肾上腺素一过性大量释放的动物模型。利用氨苄青霉素抗性特点和荧光显微镜对从内脏分离出的细菌进行鉴定。同时对各组细菌移位率和内脏组织细菌含量进行比较，组间比较采用单因素方差分析。结果:ΔqseC＋6-OHDA组(Δ-6OH组)小鼠肠系膜淋巴结(MLN)、脾脏及肝脏细菌含量都明显低于BW25113＋6-OHDA组(B-6OH组)，差异有统计学意义。MLN细菌含量，Δ-6OH组38(0～200)、B-6OH组290(0～590)， Z＝-2.038， P<0.05，差异有统计学意义。脾脏细菌含量，Δ-6OH组0(0～150)、B-6OH组128(0～270)， Z＝-1.992， P<0.05，差异有统计学意义。肝脏细菌含量，Δ-6OH组0(0～120)、B-6OH组120(0～290)， Z＝-2.008， P<0.05，差异有统计学意义。各组血浆内毒素水平结果与细菌移位结果相一致。 结论:去甲肾上腺素通过作用于肠道内大肠杆菌qseC受体，对肠道细菌移位有促进作用，该通路的阻断可抑制肠道细菌移位。

目的:对1株致下肢气性坏疽肺炎克雷伯菌（KPN）进行全基因组测序及毒力特性分析，为认识致社区获得性重症感染KPN分子毒力特征提供参考。方法:患者于2018年3月13日进入急诊科治疗，主要临床症状为高热、左下肢气性坏疽及糖尿病酮症酸中毒。取患者脓液标本进行分离培养、菌株鉴定、高黏表型及药敏检测。对菌株进行全基因组测序并分析其多位点序列分型、荚膜分型、质粒分型、毒力及耐药基因。通过接合及消除试验分析质粒特征。血清杀菌试验及大蜡螟感染模型分析菌株毒力表型，双样本 t检验比较待测菌株和对照菌株对大蜡螟幼虫半数致死率（LD 50）差异。 结果:检出菌株KPN41053，仅对氨苄西林耐药，高黏表型阴性。KPN41053染色体总长5 377 071 bp，属于ST660型，荚膜型为K16；携带一个IncFIB（K）/HI1B型毒力质粒（207 506 bp），质粒包含多种毒力因子且序列与pLVPK高度相似，但其中rmpA和rmpA2均为假基因。该质粒接合试验阴性。通过质粒消除获得变异株KPN41053_PC。毒力表型分析显示，KPN41053为血清抗性（6级），而KPN41053_PC为血清中度敏感（3级），KPN41053对大蜡螟幼虫的lgLD 50与高毒力对照株（ST23-K1型）差异无统计学意义（ t=0.32， P=0.765），低于KPN41053_PC（ t=5.97， P=0.004）。 结论:KPN41053为1株属于ST660型且高黏表型阴性的非典型高毒力KPN，毒力质粒为其关键毒力因子。KPN可导致糖尿病患者发生社区获得性气性坏疽。