猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

目的:探索烧伤患者耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌（CRKP）的质粒携带情况，分析这些质粒与CRKP传播的相关性。方法:采用回顾性观察性研究方法。取从陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院2017年1—12月收治的22例烧伤患者［男20例、女2例，年龄（42±16）岁］临床相关标本中分离保存的26株CRKP，对其进行编号。采用碱裂解法提取菌株质粒，用核酸浓度检测仪测定浓度后行琼脂糖凝胶电泳观察条带情况，并对质粒行大致分型。从各个质粒分型中选取最小编号CRKP携带质粒转化感受态大肠埃希菌TOP10菌株（以下简称TOP10菌株），观察各转化菌株与TOP10菌株涂布含氨苄西林的固体LB培养基并过夜培养后生长情况，计算成功转化比例。取成功转化TOP10菌株的最小编号CRKP携带质粒的转化菌株（以下简称最小成功转化菌株）与相应编号CRKP，提取菌株携带质粒，行琼脂糖凝胶电泳观察条带情况。取前述各成功转化菌株与TOP10菌株，采用药物敏感试验检测菌株对17种临床常用抗生素的耐药性。取最小成功转化菌株携带质粒，使用第二代测序技术进行基因测序，并完成蛋白质编码基因预测、序列比对等生物信息分析，后续根据耐药基因携带情况命名为pKP03-NDM1。根据最小成功转化菌株携带质粒全基因组序列，采用PCR法及琼脂糖凝胶电泳与基因测序检测剩余25株CRKP携带质粒的新德里金属β-内酰胺酶-1（ blaNDM-1）基因携带情况，结合文献分析26株CRKP多位点序列分型中的ST分型。 结果:从26株CRKP中均提取到质粒，质粒质量浓度为19.3~189.8 ng/μL。26株CRKP携带质粒的琼脂糖凝胶电泳均可见2 500 bp以上条带，可大致分为A、B、C、D、E、F型6个型别。过夜培养后，在含氨苄西林的固体LB培养基上，未见A、B、D、E型CRKP携带质粒转化TOP10菌株或单纯TOP10菌株菌落生长，可见3号CRKP携带的C型质粒和15号CRKP携带的F型质粒转化TOP10菌株大量菌落生长（转化菌株被分别命名为TOP10-pKP03、TOP10-pKP15），成功转化比例为1/3。TOP10-pKP03携带质粒琼脂糖凝胶电泳图仅表现为1个条带，大小与3号CRKP携带质粒最大的条带一致。TOP10菌株对所检测的17种临床常用抗生素全敏感；TOP10-pKP03和TOP10-pKP15对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素耐药，对单环β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素以及替加环素敏感。TOP10-pKP03携带质粒全长为41 190 bp，该质粒携带 blaNDM-1、 bleMBL、 T4SS、博来霉素抗性基因且包含接合转移元件、松弛酶等片段，与从大肠埃希菌JN24中提取的质粒pJN24NDM1长度相同且核苷酸相似性为99%。从16株（61.5%）CRKP携带质粒中检测到了 blaNDM-1基因，该16株CRKP的ST型别中，ST11型11株，ST215型、ST260型、ST395型、ST2230型、新ST型各1株；不携带 blaNDM-1基因的10株CRKP的ST型别中，ST11型8株，ST395型、ST2230型各1株。 结论:自烧伤患者CRKP中分离测序了一个高携带率的包含 blaNDM-1基因的质粒pKP03-NDM1，该质粒可能通过介导 blaNDM-1基因在CRKP间以及CRKP和大肠埃希菌间的水平转移，导致耐药性传播。

目的:对临床血液标本分离的细菌7712(＝CGMCC 1.17031＝NBRC 113783＝KCTC 15766)进行生物学特性和系统进化分析，明确其分类学地位。方法:观察菌株的培养特性并进行形态学、生理生化鉴定、基质辅助激光解吸电离子飞行时间质谱鉴定和基因组测序鉴定，并构建基因组发育树以分析其分类学位置。采用在线毒力基因数据库和抗生素抗性数据库，分别对分离株及近缘菌株进行基于全基因组的毒力基因和耐药基因的比较分析。结果:分离株7712为脲酶阳性的需氧革兰阴性非发酵菌，VITEK GN鉴定为人苍白杆菌。16S rRNA基因序列分析显示，分离株7712与苍白杆菌属及布鲁菌属均具有较高的序列一致性；而基于全基因系统发育分析显示，分离株7712与油葫芦苍白杆菌LCB8 T和嗜血苍白杆菌CCUG 38531 T聚类成一个分支，并与其他苍白杆菌属细菌和布鲁菌属聚类成一个大的分支。基因组亲缘性指数分析显示，分离株7712和油葫芦苍白杆菌LCB8 T的平均核苷酸一致性为98.22%，高于原核生物物种的鉴定阈值95%。分离株7712携带多种毒力基因和耐药基因，其中 OCH基因可能与头孢菌素耐药有关。 结论:确定了1例由油葫芦苍白杆菌引起的临床感染，丰富了苍白杆菌属生物多样性信息。

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)在临床高度流行，由于缺乏有效治疗药物而带来了显著挑战。 blaKPC-2编码的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2(KPC-2)是CRKP产生碳青霉烯抗性的主要原因之一。在中国和其他亚洲地区，Tn1721和IncFⅡ质粒是 blaKPC-2在缺乏规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)和限制-修饰(R-M)系统的 Kpn ST11之间转移的主要载体。转座子的结构对耐药基因的转座频率有明显影响，这可能和不同转座子的转座模式有关系。 blaKPC-2在ST11中有流行优势与ST11免疫缺陷有重要联系，用重新设计的CRISPR/Cas3系统通过接合实验传递入ST11型肺炎克雷伯菌，高危IncFⅡ质粒可以被成功剪切，从而使ST11型CRKP恢复对抗生素的敏感性，这为CRKP的临床治疗和预防提供了新思路。

目的 分析近十年来饮用水抗生素污染特研究趋势.方法 选择CNKI和WoS核心数据库为数据来源,分别以"饮用水"、"抗生素"、"drinking water","antibiotics"为主题词,对2013年1月1日-2023年7月10日数据库收录的相关文献进行检索.利用CNKI和WoS数据库的文献计量功能统计作者发文量、发表年份等.在Citespace6.2R4中根据图谱对关键词词频、中心性、关键词聚类平均轮廓值S、聚类模块值Q、发文作者和机构网络密度、网络节点N、网络连线等进行分析.结果 共检索出英文2 454篇、中文246篇相关文献,按照纳入标准和质量控制要求,最终纳入英文2 407篇、中文236篇进行分析.饮用水抗生素污染研究领域的文章总体呈上升趋势,但国内发文量与国外发文量相比差异较大;国内关键词出现频次较高的是饮用水、抗生素,国外常见关键词"Antibiotic resistance"等;国内对于抗生素抗性基因等研究弱于国外的研究;研究热点逐渐变为人体健康风险、抗生素抗性基因等.结论 饮用水抗生素污染得到国内外研究者的高度关注,今后的研究重点为饮用水抗生素抗性基因潜在的风险评估.

生物膜因具有吸附和生物降解等功能,近年来已被应用于环境污染治理.生物膜法不仅被成功应用于污水处理,在土壤重金属和有机污染物的修复中也具有较高的应用价值.随着微塑料和抗生素抗性基因(ARGs)等新污染物被广泛关注和研究,生物膜在其中发挥的作用不容忽视.本文系统综述了生物膜的结构组成、形成机制、种群和功能及近年来在环境污染治理中的应用与机制,重点论述了生物膜对重金属和有机污染物的去除机制与应用进展,并阐明了在新形势下生物膜带来的塑料际多种污染物并存、ARGs传播与病原菌富集等诸多环境问题,最后指出了目前研究存在的不足和今后的研究方向,尤其强调了探究生物膜与多种污染物之间相互作用关系与作用机制的重要性,以期为生物膜修复新技术的开发提供理论依据.

肠道微生物群在肠道疾病的发病机制中发挥着越来越重要的作用,其不仅能够改变肠道内菌群和代谢物的变化,更能直接或间接调控肠道内环境的免疫反应,最终加重肠道的损伤.抗生素作为对抗不利于肠道健康的菌群的主流药物,可通过降低肠道内细菌浓度、改变肠道微生物群的组成、调节代谢物的产生以及调控免疫反应等方式来影响肠道疾病的发病进程.但抗生素在应用于肠道疾病治疗的过程中仍存在许多不确定性,例如多重耐药病原体的出现、抗生素抗性基因的高表达以及全身性副作用及并发症的发生等.本文作者详细描述了肠道疾病的发生与肠道微生物群的关联;抗生素在肠道疾病治疗中的临床应用;并对抗生素在肠道疾病治疗中的利弊作用进行了系统总结,为抗生素在肠道疾病中的运用提供有力支撑.

目的 了解辽宁省市售鲜禽肉中空肠弯曲菌耐药表型和耐药基因遗传特征及毒力基因携带情况,为防控提供基础数据.方法 本研究采用琼脂稀释法检测9株来源于辽宁省各市市售鲜禽肉中的空肠弯曲菌的耐药表型,并对菌株进行全基因组测序,将全基因组序列与抗生素抗性基因数据库(CARD)和致病菌毒力因子(VFDB)数据库以及PubMLST数据库比对,获得基因组中的耐药基因、毒力基因和多位点序列分型(MLST)的情况.结果 9株空肠弯曲菌中8株携带介导四环素类抗生素耐药基因tet(O),耐药表型中有6株对四环素耐药.1株空肠弯曲菌耐5种抗生素,分别对萘啶酸、环丙沙星、庆大霉素、链霉素和四环素耐药.全基因组测序分析表明9株空肠弯曲菌分属6个MLST型别,以ST45和ST2274为主,多重耐药株为ST8089,耐药基因型与表型相关联.毒力基因cadF、jlpA、peb1A、rpoN、ciaB、cheY、cdtB、cdtC、htrB和waaF的携带率都为100%,flaA和cdtA的携带率均为78%.2株空肠弯曲菌携带13种毒力基因.结论 辽宁省地区鲜禽肉中空肠弯曲菌存在耐药情况,并携带多种耐药基因和毒力基因,有一定程度的引起食源性疾病的风险,因此应加强空肠弯曲菌感染监测.

目的 构建卡那霉素抗性的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antago-nist,rhIL-1Ra)菌 种,并进行rhIL-IRa蛋白的表达、纯化及质量鉴定,以降低β-内酰胺抗生素带来的风险.方法 分别以氨苄抗性的质粒rhIL-1Ra(A-rhIL-1Ra)、pET-28a为模板,进行PCR扩增,获得线性化载体和卡那霉素基因片段,经同源重组构建卡那霉素抗性的质粒rhIL-1Ra(K-rhIL-1Ra),测序正确后转化E.coli BL21(DE3),构建重组工程菌,经IPTG诱导表达后,进行CM Bestarose Fast Flow、DEAE Bestarose Fast Flow两步柱层析纯化.收集纯化产物,15％SDS-PAGE、分子排阻高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测纯度,串联质谱法检测质谱相对分子质量,Western blot法鉴定特异性,报告基因法检测生物学活性,液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)法分析比对产品相关杂质.结果 经菌落PCR及测序鉴定证明质粒K-rhIL-1Ra构建正确.表达的K-rhIL-1Ra蛋白相对分子质量约17 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％以上;两步纯化的K-rhIL-1Ra蛋白纯度分别为97％和99％,单体含量分别为99.33％和100％,色谱纯度分别为91.86％和96.96％,质谱相对分子质量与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致,可与小鼠抗人IL-1Ra单抗发生特异性反应;纯化的K-rhIL-1Ra蛋白生物学活性为1.29 × 105U/mg,相关蛋白化学修饰类型与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致.结论 成功构建了 K-rhIL-1Ra菌种,表达并纯化后的蛋白符合rhIL-1Ra的特征和质量标准,为rhIL-1Ra菌种变更及可比性研究奠定了基础.

目的 明确89K样毒力岛(PAI)的基因组特征及其在猪链球菌致病及耐药传播方面的作用.方法 通过生物信息学方法分析89K样PAIs的基因组特征;通过接合实验比较两种89K样PAIs的转移能力;采用最小抑菌浓度法测定临床分离株及接合子的耐药谱;通过C57BL/6小鼠和斑马鱼感染模型分别评估两个临床菌株及其89K样PAIs的接合子的致病性.结果 携带89K样PAIs的猪链球菌临床菌株GX54和GX82的序列型(ST)分别为ST665和ST107.菌株GX54携带的PAI大小为75Kb,在核苷酸水平上与ST7流行型菌株携带的89K PAI具有99.21％的相似性和79.00％的覆盖率,而菌株GX82携带的PAI大小为87Kb,与89K PAI具有98.80％的相似性和86.00％的覆盖率.这两个PAIs的插入位点与89K PAI相同,均位于rplL位点,且PAIs的两端均含有一段15 bp的att序列(5'-TTATTTAAGAGTAAC-3').此外,这两个PAIs均具有完整的模块化结构,包含完整的NisK-NisR样双组分信号转导系统和Ⅳ型分泌系统(T4SS).而在SalR-SalK样双组分信号转导系统中,仅SalR基因保持完整,SalK基因发生错义突变.与89K PAI相比,本研究中的两个PAIs在基因组成上呈现出一定的差异.75K PAI插入了4个基因,包括两个假定蛋白基因和两个耐药基因tet(O)和erm(B).而87K PAI则插入了12个基因,主要涉及编码与质粒相关的重组酶和假基因,以及与耐药相关的cat、tet(L)、erm(B)基因.此外,还包括编码转座酶、拓扑异构酶等基因.菌株GX54携带的75K PAI的转移频率为4.61×10-5,显著高于菌株GX82携带的87K PAI的转移频率8.46×10-6.与受体菌P1/7RIF相比,两个89K样PAIs的接合子P1/7RIF-GX54与P1/7RIF-GX82的四环素类和大环内酯类抗生素的抗性水平,以及对斑马鱼的致病力均显著增加,且两接合子组间的致病力差异无统计学意义(P＞0.05).菌株GX54和菌株GX82感染C57BL/6小鼠后,菌株GX54感染组小鼠死亡率显著高于菌株GX82感染组(P＜0.05).攻毒8 h后,两感染组小鼠的外周血细菌载量无统计学意义(P＞0.05),但菌株GX54感染组小鼠血清中的TNF-α水平显著高于菌株GX82感染组小鼠(P＜0.05),而IL-6水平在两感染组间无统计学意义(P＞0.05).sly、mrp、epf,ofs,revS,nadR,SSU05_0473,neuB及neuC等在高致病型猪链球菌中常见的毒力基因在GX54与GX82也存在.结论 本研究首次发现了猪链球菌ST665和ST107型临床菌株携带可移动的89K样PAIs.携带不同89K样PAIs的菌株毒力水平具有显著差异,该差异与菌株在感染早期诱导宿主产生TNF-α的水平密切相关,且并非由外周血中的细菌载量差异所引起.仅以包括89K样PAIs在内的已知毒力基因存在与否做为判断猪链球菌毒力水平的方法存在不足.