目的 探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响.方法 分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因.Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况.将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17～19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50 000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40nnmol/L,每孔500 μ1)的组别.经4％多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜,加入绿色IFKine?荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4 ℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况.取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BU6小鼠,为CVF组;并设置C3-/组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BU6小鼠).取10 000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示.以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)10只、C3aR-/-小鼠10只;1 000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR-/-小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1 000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)6只和C5aR-/-小鼠6只,感染后3d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止.采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析.正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验.结果 PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81 细胞株内扩增出 C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和 C5aR(374 bp)基因.Western blotting 检测结果发现,两种细胞均有 C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达.激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达.约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P＞0.05).约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR-/-小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR-/-小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre+/+C5aRflox/flox小鼠和C5aR-/-小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响.

目的 研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2(PGRP-S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响.方法 将羽化后2～4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4％～8％的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠),每组60只,饱血24 h后分离中肠和其余组织,用Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将羽化后0～1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10％蔗糖溶液),每组30只,喂养5 d后分离中肠和其余组织,RT-qPCR检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将雌性斯氏按蚊分为pgrp-s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组,每组60只,分别注射pgrp-s2的双链RNA(dsRNA)和gfp基因dsRNA(69 nl/只),2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT-qPCR检测pgrp-s2的相对转录水平,提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量.分别取30只pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊,用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后,提取RNA,RT-qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量;提取pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA,转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析.使用SMART网站预测分析PGRP-S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对.克隆按蚊pgrp-s2基因,利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbac Ⅰ)在SF9细胞中表达PGRP-S2重组蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况.取10、20、40 μg/ml纯化后的PGRP-S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40 μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育,每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况,验证PGRP-S2的酰胺酶活性.结果 RT-qPCR结果显示,吸血后24 h,感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平分别为1 590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92,感染血组高于对照组(t=2.38,P＜0.05);对照组按蚊中肠的pgrp-s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04,P＜0.05).抗生素处理组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平为0.33±0.18,低于对照组的117.9±54.5(t=2.16,P＜0.05).pgrp-s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3 653±2 023,低于gfp对照组的14 982±3 892(t=2.58,P＜0.05);摩氏摩根氏菌饲喂后,pgrp-s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571 517± 61 258,低于gfp对照组的919 754±123 397(t=2.53,P＜0.05).转录组分析结果显示,pgrp-s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、mTOR通路、FoxO通路基因,下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因.10、20、40 μg/ml PGRP-S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.49±0.07、0.40± 0.10和 0.44±0.07,均低于对照的 0.90±0.09(t=3.53、3.65、3.97,均P＜0.05);但与 Lys型肽聚糖孵育 48 h后,相对A540值分别为0.52±0.03、0.62±0.03和0.65±0.04,与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、0.31、0.11,均P＞0.05).结论 斯氏按蚊体内pgrp-s2主要在中肠表达,且表达水平受共生菌调控.PGRP-S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖,具有酰胺酶活性,可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平.

目的 研究环境温度对按蚊传疟能力的影响,并通过比较分析不同温度下斯氏按蚊天然免疫关键分子TEP1转录水平,初步探讨相关分子机制,为气候变化对疟疾传播和流行的影响提供理论依据.方法 本研究利用斯氏按蚊-约氏疟原虫动物模型,分别在24℃和28℃的环境温度下利用约氏疟原虫感染斯氏按蚊,感染后9d解剖蚊中肠,荧光显微镜下观察疟原虫卵囊发育情况并计数,比较不同温度条件下疟原虫感染率和感染度.然后,利用荧光定量PCR方法比较不同温度条件下,感染前后不同时间点的斯氏按蚊TEP1分子的转录水平.结果 在24℃的环境温度下,斯氏按蚊的感染率为91.7％,感染度为(403.9±37.09)个/蚊.在28℃的环境温度下,斯氏按蚊的感染率为38.8％,感染度为(38.63±13.91)个/蚊.24℃组的按蚊感染率和感染度均显著高于28℃组(P＜0.001).于吸血感染当天但尚未吸血时和吸血感染疟原虫后的第5天、第7天及第9天,斯氏按蚊的TEP1转录水平在28℃的条件下均高于24℃,提示斯氏按蚊TEP1参与的感染前基础免疫力和疟原虫感染中后期的免疫杀伤力28℃组均高于24℃组.结论 环境温度对按蚊传疟能力的影响较大,24℃较28℃的环境更适宜于约氏疟原虫感染斯氏按蚊;TEP1参与的天然免疫反应可能是温度对按蚊传疟能力影响的原因和分子机制之一.

目的 探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用. 方法 基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL(Py17XL)的PK9序列信息,BLAST比对PyPK9和恶性疟原虫PK9(PfPK9)以及人蛋白激酶p78的同源性.提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物,PCR扩增PK9基因.采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒.重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序.10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验.每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况.200只3～5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只.于吸血8d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量.10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验.每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间. 结果 PyPK9与PfPK9的序列一致性为82.5％,PyPK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4％.PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp.经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功,Py17XL虫株成功敲除PK9基因.WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5～6d全部死亡,PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失.WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0％ (9/15)和66.7％ (10/15),差异无统计学意义(P＞0.05).WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症. 结论 PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用.

[目的]Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用.本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能.[方法]根据冈比亚按蚊Anopheles gambiae Toll受体家族的蛋白氨基酸序列,通过序列同源比对鉴定斯氏按蚊中相应的Toll受体基因;运用荧光定量PCR检测Toll受体基因在未感染病原菌的斯氏按蚊脂肪体中的相对表达量,以及在真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana和革兰氏阴性细菌胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp.carotovora侵染斯氏按蚊过程中的表达变化;最后,在斯氏按蚊雌成蚊胸部显微注射As Toll1A和AsToll5A的双链RNA进行RNA干扰后,检测RNAi处理的斯氏按蚊受真菌侵染后的存活率、肠道细菌含量变化以及抗菌肽基因表达变化.[结果]在斯氏按蚊中共鉴定到8个Toll受体基因,即As TollA,AsToll5A,AsToll6,AsToll7,AsToll8,AsToll9,AsToll1O和As Toll11.通过荧光定量PCR检测发现,未感染病原菌的斯氏按蚊雌成蚊脂肪体中AsToll5A表达量最高,As TollA表达量次之,其余Toll受体基因表达量极低.在球孢白僵菌和胡萝卜软腐欧文氏菌侵染过程中,与对照(注射PBS)比较,As Toll1A和As Toll5在斯氏按蚊中的表达量显著升高,其余Toll受体基因表达变化不显著或降低.RNA干扰结果表明,As TollA或AsToll5A的表达受到抑制后,斯氏按蚊对球孢白僵菌的抵抗能力显著降低,肠道细菌总量与对照(dsGFP)比较显著增多.而且,抑制As Toll1A后抗菌肽基因DEF1和GAM1的表达受到显著抑制;抑制AsToll5A后仅有GAM1表达量下调.[结论]斯氏按蚊Toll受体在结构和功能上具有高度的保守性,其中As TollA和AsToll5A能响应病原真菌和革兰氏阴性细菌侵染并且影响肠道菌稳态.

目的 对斯氏按蚊MyD88基因进行生物信息学分析,并研究其在抗约氏疟原虫感染中的作用.方法 首先,通过VectorBase数据库获取斯氏按蚊MyD88基因cDNA序列,并利用VectorNTI、DNAMAN等软件对MyD88基因cD-NA序列进行生物信息学分析.然后,根据MyD88的cDNA序列设计Real-time PCR引物,提取斯氏按蚊总RNA,通过反转录合成cDNA,利用Real-time PCR方法检测MyD88基因在蚊各个生活史阶段转录水平情况及其在约氏疟原虫感染后的转录水平变化.结果 斯氏按蚊MyD88基因位于斯氏按蚊KB664619号染色体155 163～158 066 bp的反义链上,包含两个外显子,其cDNA全长1 383 bp,编码460个氨基酸.系统发育树结果显示,斯氏按蚊与大劣按蚊和冈比亚按蚊系统发育的距离近,其氨基酸序列同源性达79％.对斯氏按蚊各时期MyD88基因转录水平的研究结果显示,吸食正常血和感染血均能够上调MyD88的转录,吸血后3d和5d吸感染血组MyD88基因转录水平上调明显,显著高于正常血组和未吸血组.结论 本研究证实了Toll信号通路中的MyD88基因在蚊抗疟原虫感染的天然免疫中发挥了重要作用,在感染后3d时作用明显.

目的 研究环境温度对按蚊繁殖能力的影响及其分子机制.方法 在16、20、24、28、32℃5个温度梯度下进行斯氏按蚊的饲养,比较分析不同温度下斯氏按蚊的产卵能力和生存时间.并在饲血前后不同时间点提取斯氏按蚊总RNA,利用RT-qPCR的方法检测按蚊卵黄蛋白原(Vg)分子转录水平.结果 在16℃的环境温度下斯氏按蚊停止繁殖,20℃的产卵率明显低于24、28和32℃(P＜0.05),其余各组间的产卵率比较则无统计学差异.在20 ～ 28℃温度范围内,随着环境温度升高斯氏按蚊的产卵时间逐渐缩短(P＜0.001)、产卵数量逐渐增高(P＜0.05,P＜0.01)、生存时间逐渐延长(P＜0.05,P＜0.01);当环境温度升至32℃时,与28℃比较,斯氏按蚊的产卵时间进一步缩短(P＞0.05),但产卵数量明显减少(P＜0.01),且生存时间明显缩短(P＜0.01).Vg转录水平在16℃下吸血前后始终处于基础低表达水平,其他各组在吸血后24 h显著升高,各温度间转录水平有统计学差异(P＜0.01),且与产卵数量差异趋势一致.结论 28℃是斯氏按蚊繁殖和生存的最佳环境温度,其分子机制可能是通过温度影响卵黄蛋白原表达水平而实现的.

目的 分析斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白PGRP-LB的序列,表达和纯化PGRP-LB蛋白. 方法 采用生物信息学方法分析PGRP-LB蛋白的序列.以斯氏按蚊的cDNA为模板PCR扩增PGRP-LB,采用无缝克隆的方法将其克隆到原核表达载体pET28a中,然后转化入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行目的蛋白的诱导表达.SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色检测PGRP-LB的表达情况.经镍离子亲和层析纯化后,Bradford法检测洗脱液的浓度.通过MEGA7软件构建系统进化树,进行PGRP-LB的进化分析. 结果 成功获得pET28a-PGRP-LB的重组质粒,37℃、0.5 mmol/L的IPTG能诱导出大量的包涵体PGRP-LB重组蛋白,相对分子质量约为26×103,纯化后的蛋白浓度为0.5 mg/ml.进化分析显示,斯氏按蚊PGRP-LB与同科物种间亲缘关系较近. 结论 成功使用大肠埃希菌原核表达系统表达斯氏按蚊PGRP-LB蛋白,为该蛋白在按蚊体内的定位及功能研究奠定了基础.

目的 对约氏疟原虫感染后8、11和14d的斯氏按蚊进行转录组测序,分析约氏疟原虫血淋巴子孢子诱导斯氏按蚊的免疫信号通路及效应机制.方法 约氏疟原虫BY265株按常规腹腔接种感染健康昆明小鼠,3 d后选择血液内有配子体的小鼠供斯氏按蚊雌蚊吸血,于吸血感染后8、11和14 d各取斯氏按蚊20只,提取总RNA进行高通量转录组测序,分析按蚊基因表达情况;使用统计算法Bray Curtis进行层级聚类,分析各样本间基因表达的差异;根据每百万转录本(TPM)值进行差异基因分析;使用gplots package软件绘制聚类热图,分析感染后8、11和14d,Toll信号通路(Toll)、免疫缺陷信号通路(Imd)、信号转导和转录激活因子(STAT)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)通路,效应分子如含硫酯蛋白家族分子(TEP)、抗菌肽、一氧化氮合酶(NOS)、硝化反应相关分子等的表达情况;利用实时荧光定量PCR(qPCR)扩增Rel1、Rel2转录因子、含硫脂蛋白分子(TEP1)和血红素过氧化物酶(HPX8)进行验证.结果 层级聚类分析显示,斯氏按蚊感染后11 d与8d和14d的基因表达变化差异较大.差异基因分析结果显示,斯氏按蚊感染后11 d与8d相比,有1109个基因上调,257个基因下调;感染后14d与8d相比,有62个基因上调,136个基因下调;感染后14 d与11 d相比,有174个基因上调,196个基因下调.聚类热图分析结果显示,在感染后11 d与8 d和14d的比较中,斯氏按蚊Rel1转录因子、Toll5A和Toll1A受体分别上调约1.9、1.8和2.1倍;双过氧化物酶和双氧化酶均上调约2倍;HPX8上调约1.5倍.qPCR验证结果显示,感染后11 d Rel1、Rel2和HPX8的相对表达量为3.43、3.95和4.01,与对照组的0.82、0.88和1.01差异有统计学意义(P＜0.01).结论 约氏疟原虫血淋巴子孢子可诱导斯氏按蚊Toll信号通路通过直接或协调其他通路调控硝化反应相关分子表达.

不久前,从法国自然博物馆动物实验室引进了约氏鼠疟原虫(Plasmodium Yoclii BY 625).在国外,关于各纯系小鼠对此寄生虫的敏感性的比较研究报导不多,但对于伯氏鼠疟原虫则观察得比较仔细.国内的有关研究报导很少.考虑到小鼠是疟疾实验研究中最常用的动物,找到易于感染约氏疟原虫的小鼠品系是有意义的.本文报导了下述实验的结果:以此种寄生虫感染约10系小鼠,并比较各系的敏感性.感染采用子孢子和输血方法,然后观察它们在鼠体内的消长规律.再对斯氏按蚊(Anopheles Stcphensi)吮吸了各系阳性小鼠后其腺感染率等问题也进行了观察.