目的:探讨基于定量蛋白质组学串联质谱标签（TMT）技术筛选糖尿病足皮肤抗菌肽的可行性和价值。方法:收集2017年4月至2018年12月在东南大学附属中大医院行清创手术的糖尿病足患者的下肢溃疡周围皮肤全层和同期行其他手术非糖尿病患者的下肢皮肤全层标本各3例患者标本。利用TMT技术分别对上述标本进行蛋白组学分析，筛选出发生显著变化的差异蛋白。搜索UniProt-GOA数据库对鉴定到的差异蛋白生物学作用阐释。以鉴定到的蛋白为背景，利用Fisher精确检验法评价差异表达蛋白。利用InterPro数据库分析差异表达蛋白功能结构域的富集情况。结果:共发现133个差异蛋白，其中表达上调和下调的蛋白分别为101个和32个。基因本体（GO）富集分析表明，在蛋白生物学过程中最显著富集的过程为对细菌的防御过程，其次为抗菌体液反应过程。共有19个蛋白涉及对细菌的防御反应过程，其中18个蛋白发生了上调，1个蛋白发生了下调。差异蛋白上调倍数达4倍以上的共有8个，分别为蛋白为溶菌酶C、中性粒细胞弹性蛋白酶、杀菌渗透性增加蛋白、乳铁蛋白、膜相关磷脂酶A2、肽聚糖识别蛋白1、免疫球蛋白J链和蛋白S100-A12。共有8个蛋白涉及抗菌体液反应过程，其中7个蛋白与对细菌的防御反应中涉及的蛋白重叠。通过蛋白互作分析显示，差异表达的抗菌反应蛋白形成了一个包含14个节点和34条边的复杂调控网络，平均节点度为4.86，聚类系数为0.652。结论:通过TMT标记蛋白组学技术发现，参与对细菌的防御反应及抗菌体液免疫反应的差异蛋白，如溶菌酶C、中性粒细胞弹性蛋白酶、杀菌渗透性增加蛋白、乳铁蛋白、膜相关磷脂酶A2、肽聚糖识别蛋白1、免疫球蛋白J链和蛋白S100-A12，有望成为治疗糖尿病足感染的新靶点。

目的 研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2(PGRP-S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响.方法 将羽化后2～4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4％～8％的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠),每组60只,饱血24 h后分离中肠和其余组织,用Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将羽化后0～1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10％蔗糖溶液),每组30只,喂养5 d后分离中肠和其余组织,RT-qPCR检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将雌性斯氏按蚊分为pgrp-s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组,每组60只,分别注射pgrp-s2的双链RNA(dsRNA)和gfp基因dsRNA(69 nl/只),2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT-qPCR检测pgrp-s2的相对转录水平,提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量.分别取30只pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊,用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后,提取RNA,RT-qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量;提取pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA,转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析.使用SMART网站预测分析PGRP-S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对.克隆按蚊pgrp-s2基因,利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbac Ⅰ)在SF9细胞中表达PGRP-S2重组蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况.取10、20、40 μg/ml纯化后的PGRP-S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40 μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育,每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况,验证PGRP-S2的酰胺酶活性.结果 RT-qPCR结果显示,吸血后24 h,感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平分别为1 590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92,感染血组高于对照组(t=2.38,P＜0.05);对照组按蚊中肠的pgrp-s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04,P＜0.05).抗生素处理组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平为0.33±0.18,低于对照组的117.9±54.5(t=2.16,P＜0.05).pgrp-s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3 653±2 023,低于gfp对照组的14 982±3 892(t=2.58,P＜0.05);摩氏摩根氏菌饲喂后,pgrp-s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571 517± 61 258,低于gfp对照组的919 754±123 397(t=2.53,P＜0.05).转录组分析结果显示,pgrp-s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、mTOR通路、FoxO通路基因,下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因.10、20、40 μg/ml PGRP-S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.49±0.07、0.40± 0.10和 0.44±0.07,均低于对照的 0.90±0.09(t=3.53、3.65、3.97,均P＜0.05);但与 Lys型肽聚糖孵育 48 h后,相对A540值分别为0.52±0.03、0.62±0.03和0.65±0.04,与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、0.31、0.11,均P＞0.05).结论 斯氏按蚊体内pgrp-s2主要在中肠表达,且表达水平受共生菌调控.PGRP-S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖,具有酰胺酶活性,可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平.

实验构建了大鲵短型肽聚糖识别蛋白PGRP-S的真核表达质粒, 并对其功能进行了初步的研究.序列分析显示, 所克隆的大鲵PGRP-S的N端不含有信号肽; 其编码的氨基酸序列具有2个相距较近的半胱氨酸残基以及2个Zn2+结合位点.Western-blotting检测结果显示大鲵PGRP-S既可分泌到胞外, 也可滞留在胞内.体外抗菌实验的结果表明,过表达大鲵PGRP-S能显著抑制迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)在HEK293T细胞内和胞外培养基中的增殖.此外, 过表达大鲵PGRP-S能诱导NF-κB启动子的活性; 能结合Lys-type和Dap-type的肽聚糖但不能降解它们.研究结果表明大鲵PGRP-S在功能上类似于哺乳动物而有别于硬骨鱼类短型的肽聚糖识别蛋白.

[目的]旨在研究光滑鳖甲Anatolica polita肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)基因ApPGRP表达模式及其对下游免疫相关基因的表达调控,以及重组蛋白ApPGRP与细菌的结合能力.[方法]构建原核表达载体pET-28a-ApPGRP,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),诱导表达并纯化重组蛋白His-ApPGRP,分别测定其与金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和肽聚糖(peptidoglycan,PGN)的结合能力.金黄色葡萄球菌S.aureus刺激后,利用qRT-PCR检测光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP、抗菌肽基因ApAttacin2和ApAttacin1、防御素基因ApDefensin、丝氨酸蛋白酶基因ApSP和丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin等免疫相关基因的表达水平;采用RNAi技术沉默光滑鳖甲6龄幼虫体内ApPGRP基因的表达,并利用qRT-PCR分别检测RNAi处理以及RNAi后再用s.aureus刺激时幼虫体内上述基因的表达水平变化.[结果]通过原核表达获得了重组蛋白His-ApPGRP,其具有结合金黄色葡萄球菌和肽聚糖的能力.注射金黄色葡萄球菌后,检测的光滑鳖甲6龄幼虫免疫相关基因(ApSP除外)的表达都显著上调;RNAi沉默光滑鳖甲6龄幼虫ApPGRP后,其他免疫相关基因表达量均显著降低,其响应金黄色葡萄球菌刺激后的表达量也显著低于对照组.[结论]这些结果表明,ApPGRP在光滑鳖甲免疫防御中起着识别外源微生物,激活信号通路并调控抗菌肽表达的作用.

肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)对于昆虫来说是一种高度保守的病原识别蛋白.为阐明PGRP-S2在小菜蛾Plutella xylostella抵抗病原微生物过程中的作用,本研究结合RT-PCR和RACE技术克隆得到小菜蛾PGRP-S2基因的cDNA全长序列,命名为PGRP-S2(GenBank登录号:MG570190).生物信息学分析结果表明,PGRP-S2的开放阅读框为588 bp,编码195个氨基酸;蛋白质预测分子量为21.46 kDa,理论等电点为8.46;编码蛋白具有PGRP超家族保守结构域和酰胺酶结构域,是典型的肽聚糖识别蛋白,包含一条信号肽,不存在跨膜结构;同源序列比对和系统进化树分析表明PGRP-S2与家蚕Bombyx mori的BmPGRP-S1进化距离最近.利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)高效表达重组蛋白PxPGRP-S2,利用倒置显微镜及平板涂布观察重组蛋白对大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的作用,结果表明PxPGRP-S2蛋白能够与两种细菌发生结合并凝集细菌,但不具备直接杀菌功能.本研究为进一步研究基于PGRP-S2介导的小菜蛾免疫防御反应提供基础.

[目的]肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan-recognition proteins,PGRP)可以特异性识别细菌细胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan,PGN),并通过免疫缺陷(immune deficiency,IMD)途径和Toll途径诱导昆虫抗菌肽的产生.本研究旨在探讨家蚕Bombyxmori肽聚糖识别蛋白BmPGRP-S5的抑菌活性及在引发家蚕细胞免疫中的作用.[方法]用果蝇胚胎S2细胞表达BmPGRP-S5蛋白;通过细菌生长曲线法检测BmPGRP-S5蛋白对大肠杆菌Escherichia coli K12 D31、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 的抑菌活性;ELISA检测BmPGRP-S5蛋白与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis胞壁组分的结合力;通过测定吸光值和观察家蚕血淋巴黑化反应分析BmPGRP-S5对细菌胞壁组分激活酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)的影响,并通过异硫氰酸荧光素(FITC)标记法检测BmPGRP-S5对家蚕血细胞吞噬细菌的影响.[结果]获得表达纯化的BmPGRP-S5蛋白.BmPGRP-S5蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31和巨大芽孢杆菌无抑菌效果,加入40 pmol/L的Zn2+后,其对巨大芽孢杆菌的抑菌效果明显增强.ELISA结果表明,BmPGRP-S5蛋白与来自金黄色葡萄球菌的PGN和枯草芽孢杆菌脂磷壁酸(LTA)的结合能力较强,同时也促进了这两种细菌胞壁组分激活家蚕血淋巴酚氧化酶原,加快胞璧组分介导的家蚕血淋巴黑化反应.加入BmPGRP-S5蛋白后,家蚕血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率提高到53.33％左右,对大肠杆菌K12D31的吞噬率在25.83％左右,对巨大芽孢杆菌的吞噬率达30.83％左右,与对照组相比显著增强.[结论]BmPGRP-S5抑菌作用依赖于Zn2+,可能与其酰胺酶活性有关.BmPGRP-S5可以通过识别细菌胞壁组分PGN或LTA在家蚕的黑化反应和细胞吞噬中发挥作用.本研究使用的BmPGRP-S5蛋白是通过在果蝇S2细胞进行重组表达获得,更能真实地反映其在昆虫体内生理状态下的功能活性.因此,本研究的结果对进一步开发利用BmPGRP-S5有指导意义.

[目的]明确入侵害虫红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2在肠道菌群稳态的维持和调控过程中的作用,将为靶向破坏肠道菌群稳态的害虫控制新策略研发提供新的科学依据和作用靶标.[方法]利用生物信息学方法分析RfPGRP-L2的序列特征.利用RT-qPCR分析RfPGRP-L2在健康红棕象甲4龄幼虫不同组织(头、脂肪体、表皮、前肠、中-后肠、血淋巴)以及大肠杆菌Escherichia coli DH5α和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus经注射(注射1μL OD600=1.6的菌液)和喂食(取食涂抹1 mLOD600=1.6的菌液的甘蔗薄片)两种不同方式分别感染后红棕象甲4龄幼虫肠道和脂肪体中的表达量;进行RfPGRP-L2原核表达,利用体外孵育方法检测重组蛋白RfPGRP-L2对大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌的凝集和抑菌活性;RNAi干扰RfPGRP-L2后,检测红棕象甲4龄幼虫血淋巴和肠道中大肠杆菌菌落数的变化;利用RT-qPCR分析RNAi干扰RfPGRP-L2后红棕象甲4龄幼虫脂肪体和肠道中抗菌肽基因表达量的变化;利用基于细菌16S rRNA的高通量测序分析RNAi干扰RfPGRP-L2对健康红棕象甲4龄幼虫肠道菌群结构组成的影响.[结果]SMART预测发现红棕象甲RfPGRP-L2基因编码的蛋白中无跨膜结构域也无信号肽,这表明RfPGRP-L2是一种胞质型肽聚糖识别蛋白.RT-qPCR检测发现,RfPGRP-L2主要在健康红棕象甲4龄幼虫血淋巴、肠道和脂肪体等免疫组织中表达;被注射感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌6h和12 h后,红棕象甲4龄幼虫脂肪体中RfPGRP-L2的表达量分别显著上调;被喂食感染大肠杆菌6h后,红棕象甲4龄幼虫肠道中RfPGRP-L2的表达量显著增加.重组表达蛋白RfPGRP-L2能引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌发生凝集反应,这说明RfPGRP-L2能够识别这两种细菌.当RfPGRP-L2被干扰后,红棕象甲4龄幼虫对肠道和血淋巴中感染EGFP标记的大肠杆菌的清除能力显著弱于对照组;肠道中抗菌肽基因RfCecropin的表达量显著降低;健康红棕象甲4龄幼虫肠道中细菌的菌落数量显著高于对照组,而且肠道菌群结构组成也发生了明显的变化.[结论]红棕象甲体内胞质型肽聚糖识别蛋白RfPGRP-L2能够通过识别细菌并激活肠上皮细胞中相应的免疫信号通路促进抗菌肽基因的表达,从而介导对肠道菌群稳态的调控.

[目的]本研究旨在阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫体内肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)在响应苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)感染过程中的功能.[方法]利用PCR方法扩增甜菜夜蛾幼虫肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA全长cDNA;采用qRT-PCR分析SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、预蛹和蛹)及4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、围食膜、脂肪体、血淋巴和表皮)中的表达.通过RNAi技术沉默SePGRP-SA基因72 h后,qRT-PCR检测SePGRP-SA沉默效率及甜菜夜蛾4龄幼虫中肠抗菌肽相关基因(Ceropin,Attacin和Defensin)和细菌载量的变化.RNAi沉默SePGRP-SA 24 h后,以苏云金芽胞杆菌菌株Bt-GS57饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫0,24,48,72,96和120 h,计算幼虫校正死亡率;饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫 Bt-GS57 后 0,24,48 和 72 h,利用 qRT-PCR 检测中肠 SePGRP-SA,Ceropin,Attacin 和 Deffensin的相对表达量.[结果]克隆获得甜菜夜蛾SePGRP-SA全长DNA(GenBank登录号:MW265930),开放阅读框长576 bp,编码191个氨基酸,其编码蛋白的预测分子量为21.59 kD.序列分析结果表明,SePGRP-SA具有典型的PGRP和Ami2保守结构域,信号肽为19个氨基酸,为分泌型蛋白;系统进化分析发现,SePGRP-SA与斜纹夜蛾Spodoptera litura的S1PGRP亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达91.1％.发育表达谱结果表明SePGRP-SA在甜菜夜蛾4和5龄幼虫、预蛹和蛹中高表达;组织表达谱结果表明,SePGRP-SA在4龄幼虫各组织中均表达,其中以血淋巴中表达量最高.与注射dsEGFP(对照)相比,注射dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫在72 h时中肠SePGRP-SA基因表达量下调了 95.26％,Cecropin,Attacin和Deffensin表达量显著下调,中肠细菌载量显著升高.注射dsEGFP和dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫饲喂Bt-GS57,72 h时幼虫校正死亡率分别为50.00％和73.33％,表明幼虫对Bt-GS57的敏感性明显增加.甜菜夜蛾4龄幼虫取食Bt-GS57后,中肠SePGRP-SA,Cecropin,Attacin和Defensin表达量在48 h均显著增加,72 h时降低.[结论]Bt侵染能够引起甜菜夜蛾SePGRP-SA基因激活抗菌肽相关基因Cecropin,Attacin和Defensin的表达.

昆虫可通过体内肽聚糖识别蛋白识别外来微生物的肽聚糖而启动免疫机制,从而降低微生物对昆虫自身的影响,但关于蚊虫的相关报道较少.为了解埃及伊蚊的肽聚糖识别蛋白特性,本研究通过分子克隆技术,成功克隆并测序获得了埃及伊蚊肽聚糖识别蛋白AePGRP-S2的ORF序列.该ORF序列有510个碱基,可编码170个氨基酸.生信分析发现其具有典型的PGRP超家族保守结构域与酰胺酶结构域,表明该基因序列很有可能为埃及伊蚊的肽聚糖识别蛋白基因,且可能具有直接的抗菌活性.通过系统进化树分析,发现埃及伊蚊PGRP-S2与埃及伊蚊的PGRP-S的亲缘关系最近;为进一步获得埃及伊蚊肽聚糖识别蛋白AePGRP-S2,本研究构建表达载体,并将靶基因原核表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,通过SDS-PAGE及Western Blot的检测,获得46 kDa目的蛋白,为进一步深入了解埃及伊蚊体内肽聚糖识别蛋白PGRP的功能及作用机制奠定基础.