目的 建立采用 4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)衍生-高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)法(DMB衍生法)同时测定重组人促卵泡激素(rhFSH)中2 种唾液酸组分N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)含量的方法.方法 将DMB衍生法与邻苯二胺衍生-高效液相色谱法(邻苯二胺衍生法)进行对比研究,对DMB衍生法中的水解条件进行优化并确定最终方法为rhFSH原液经酸水解后,采用DMB进行衍生,经Agilent ZORBAX 300SB-C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分离,采用荧光检测器检测.结果 与邻苯二胺衍生法相比,DMB衍生法能够实现Neu5Gc与Neu5Ac相关杂质的有效分离.该方法Neu5Gc和Neu5Ac 分别在0.5～5.0 μg·mL-1(r=0.999 9)和25～250 μg·mL-1(r=0.999 8)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系;Neu5Gc和Neu5Ac的检测限分别为11.07、10.30 ng·mL-1,定量限分别为33.21、20.60 ng·mL-1,两者回收率分别为(99.63±1.33)%(n=9)和(100.62±1.58)%(n=9),RSD分别为1.3%(n=9)和1.5%(n=9).结论 该方法专属性强、灵敏度高、精密度和准确度良好,可用于准确测定rhFSH中唾液酸Neu5Gc和Neu5Ac的含量.

目的 建立一种灵敏、准确、简单地测定人红细胞中甲氨蝶呤(MTX)及多聚谷氨酸甲氨蝶呤(MTXPG2和MTXPG3)浓度的方法.方法 采用双三元液相色谱系统串联荧光检测器,使用C18-WP柱(20 mmx4 mm,5 μm)作为在线固相萃取柱,Athena C18-WP柱(150 mm ×4.6 mm,3 μm)作为分析柱.红细胞裂解液用硫酸锌-10％甲酸的甲醇(100:90,v/v)沉淀蛋白,柱后添加H2O2光化学衍生MTXPGs,荧光检测激发波长为274 nm,发射波长为470 nm,柱温为40 ℃,进样体积为100 μL.考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、稳定性.结果 MTX/MTXPG2和 MTXPG3在 12.5～400.0 nmol·L-1 线性良好,MTX的标准曲线为y=763.8x-2 961.1(R2=0.999 5),提取回收率为60.7％～66.1％;MTXPG2的标准曲线为 y=1 017.8x-239.8(R2=0.998 4),提取回收率为 67.2％～67.3％;MTXPG3 的标准曲线为 y=1 069.1x-819.6(R2=0.999 4),提取回收率为62.9％～70.1％;日内精密度RSD＜8.8％,日间精密度RSD＜10.8％.结论 本方法准确、重现性好,采用在线固相萃取富集及分离目标化合物,简化了样品前处理步骤,提高分析效率,适用于检测类风湿性关节炎患者红细胞内MTX、MTXPG2和MTXPG3浓度.

目的 构建再生基因 4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞 293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV).方法 根据 NCBI 数据库REG4 基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4 载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4 质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1 质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组.荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平.通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶 S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定.结果 经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4 构建成功.转染对照组(pEGFP-C1 质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约 50%,表明转染成功.WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4 质粒)的细胞中检测到Reg IV蛋白.镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,Sephacryl S-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白.结论 成功构建了REG4 基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础.

目的:建立高效液相色谱法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量,并通过对31批样品检测结果的分析初步研究小儿扶脾颗粒在黄曲霉毒素污染方面的安全性,以提示企业选择安全的原料药材投料.方法:采用柱后光化学衍生HPLC法测定小儿扶脾颗粒中黄曲霉毒素的含量.采用Ecosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-乙腈-水(30:10: 60),荧光检测器,激发波长为360 nm,发射波长为450 nm,流速为0.8 ml·min-1,柱温为30℃进样量为20μl.结果:黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别在9.65 ~48.25 pg(r=0.9991)、2.45 ~12.25 pg (r=0.9998)、10.5 ~52.5 pg(r =0.9956)、2.55 ~12.75 pg(r=0.9966)范围内线性关系良好;加样回收率在83.3% ~95.6%之间.有14批样品检出黄曲霉毒素,其总含量为0.21 × 10-3~0.54 ×10-3μg·g-1.结论:该方法操作简便,结果稳定可靠,可用于小儿扶脾颗粒的质量控制.

目的:建立免疫亲和柱净化HPLC柱后光化学衍生法测定珠子参药材中真菌毒素(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA)的方法.方法:参考2015年版《中国人民共和国药典》及相关文献对珠子参药材中真菌毒素(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA)进行测定.结果:本实验采用的柱后光衍生荧光检测法测定的AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA的检测下限分别为0.19、0.63、0.19、0.56、4.0 μg ·kg-1,珠子参药材真菌毒素回收率为78％ ～ 110％.结论:实验结果表明柱后光衍生荧光检测法具有更高的灵敏度,且该分析方法适合于珠子参药材及饮片中这些真菌毒素的检测.

目的 建立一种水产品中甲醛柱后衍生-高效液相色谱荧光检测的分析方法.方法 样品经过三氯乙酸超声提取后,过滤进样,经反相ODS-C18柱分离,在衍生池温度为100℃条件下,与0.05 mol/L乙酰丙酮、0.81 mol/L乙酸铵进行衍生,荧光检测器检测,外标法定量.结果 甲醛质量浓度在0.025～10.0 mg/L范围内呈良好线性,相关系数为0.999 3,方法检出限为0.10 mg/kg,定量限为0.25 mg/kg,加标回收率为84％～95％.与水蒸气蒸馏-分光光度法比较,差异无统计学意义.结论 方法前处理简单,于扰少,检出限低,适用于水产品中甲醛含量的测定.

目的 优化高效液相色谱法检测黄曲霉毒素的条件,并与ELISA检测法、分子生物学检测法比较,为黄曲霉毒素的检测提供技术参考.方法 毒株培养液经三氟乙酸衍生,C18色谱柱分离,以乙腈和水(35:65,v/v)为流动相,流速1.0ml/min,荧光检测器检测(激发波长360 nm,发射波长440 nm);同时采用ELISA试剂盒检测黄曲霉毒素,分子生物学方法检测产毒基因,比较检测方法的差异.结果 HPLC法检测AFG1、AFB1、AFG2、AFB2的检出限分别为0.05、0.03、0.02、0.01 μg/L,线性相关系数大于0.999,相对标准差(RSD)＜10％,平均回收率范围为73.22％～ 126.73％;61株黄曲霉菌株7d培养液中,HPLC法阳性检出率为98.40％,ELISA法阳性检出率为57.40％,差异具有统计学意义(Z=-3.76,P＜0.05);分子生物学法阳性检出率为40.98％,与HPLC法结果差异具有统计学意义(x2=33.03,P＜0.05).结论 HPLC法可满足黄曲霉培养液中4种黄曲霉毒素的同时检测,且方法灵敏度高于ELISA和分子生物学法,为后续更为高效检测黄曲霉毒素的研究提供技术参考.

目的 分析草甘膦在经过氯消毒的饮用水中的分解情况,为农村及边远地区饮用水安全提供科学依据.方法 配制总体积相同、草甘膦含量相同但余氯含量不同的系列混合溶液,溶液中草甘膦经超高效液相色谱柱富集分离后,与衍生试剂反应生成强荧光物质,以荧光检测器检测定量,经高效液相串联质谱联用仪进行确认.结果 溶液中草甘膦与余氯经过1h的反应,两者的含量为稳定值,表明草甘膦与余氯在1h内已经完全反应达到平衡状态;随着余氯浓度的增大,草甘膦的含量逐渐减少直至全部分解,当溶液中余氯浓度大于1.3 μg/ml时,溶液中草甘膦检测结果为未检出,经过高效液相色谱-串联质谱联用仪的确认,检测结果具有一致性.结论 饮用水中余氯对草甘膦的分解有较大影响,农村及边远地区饮用水通过氯消毒可降低草甘膦对人体健康产生的危害.

目的:探讨不同储藏条件对薏苡仁真菌毒素含量的影响.方法:取新鲜薏苡仁与中药房处理后薏苡仁2批薏苡仁为观察对象,模拟低温密封、高温高湿以及通风干燥3种储藏条件,在储藏0、30、90天,运用免疫亲和柱净化-在线柱后光化学衍生-高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)对其黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)与玉米赤霉烯酮(ZON)7种真菌毒素含量变化进行检测.结果:在通风干燥的条件下,AFB1与AFB2含量增加幅度最大;在高温高湿的储藏条件下,AF含量未出现明显变化;在低温密封的储藏条件下,薏苡仁中AF含量表现为缓慢增长.在高温高湿以及通风干燥的环境下,薏苡仁中ZON会迅速增加;在通风干燥的环境下,薏苡仁ZON含量增加的幅度更大;在低温密封的环境下,短时间内可对ZON含量进行抑制.结论:不同的储藏条件下,薏苡仁中真菌毒素的含量会发生不同的改变,但还需进行大样本验证,具体机理也需要作进一步的研究.

目的 建立高效液相色谱荧光检测法,测定人血浆中内源性维生素K同系物的浓度.方法 应用氯化亚锡使维生素K同系物发生荧光衍生,盐析液液萃取后采用色谱柱AQ-C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相甲醇-水(98:2,V/V),流速1mL· min-1,激发波长248 nm,发射波长418 nm,柱温30℃进行分析.结果 内源性维生素K1(VKl)的标准曲线方程为Ya=2.944ρa+0.023(r =0.999 8),定量范围1.000 ～50.036 ng· mL-1,内源性维生素K2(VK2)的标准曲线方程为Yh=1.195ρb+2.653(r =0.999 7),定量范围5.006 ～100.124 ng· mL-1.VK1和VK2的精密度、稳定性、重复性及冻融试验的相对标准偏差(RSD)均小于10％,符合生物样品的测定需要.结论该法操作简便、灵敏、准确,适用于的内源性维生素K同系物测定.