目的 通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶 2(fucosyl-transferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系.方法 构建FUT2 慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000 将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2 包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2 细胞系.PCR鉴定FUT2 基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2 细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2 细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性.结果 成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2 细胞系,PCR验证显示,FUT2 基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中.HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA水平提高了 330 倍.99.9%的HEK-293T/FUT2 细胞表达H2 型人类组织血型抗原.GI.1 重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2 细胞产生很好的结合反应,EC50为 2.007 μg/mL.结论 建立了H2 型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1 型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法.

目的:探讨通过外泌体靶向运载整合素αv/β3小干扰(si)RNA(si-αv/β3)对未分化甲状腺癌(ATC)细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:采用蛋白质印迹法(Western blot)检测整合素αv/β3在ATC细胞系(8505C、Hth7)及人正常甲状腺细胞(上海生命科学院细胞所)中的表达；将含内化精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽(iRGD)的质粒转染人源胚胎肾细胞HEK-293T后采用超高速离心法得到靶向外泌体，采用PKH26染色验证其靶向性；进一步通过转染获得靶向运载si-αv/β3的外泌体iRGD-exos-si-av/β3(载siRNA组)，将其同8505C细胞共孵育后，采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测载siRNA组与空载外泌体组8505C细胞内整合素αv/β3的mRNA和蛋白表达水平。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验和Transwell检测8505C细胞的增殖、迁移及侵袭能力。两样本间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:整合素αv/β3在8505C及Hth7细胞中的表达量显著高于人正常甲状腺细胞(αv：1.04±0.12、0.90±0.11比0.31±0.01， F＝50.11， P<0.01；β3：0.93±0.23、0.89±0.16比0.33±0.27， F＝6.81， P<0.05)。iRGD靶向外泌体在细胞中的荧光信号明显高于非靶向外泌体组(47.18±10.39比5.64±1.43， t＝6.86， P<0.05)。转染si-αv/β3至8505C细胞后，mRNA水平表达显著低于对照组(αv：0.20±0.01比1.21±0.14， t＝12.49， P<0.05；β3：0.21±0.02比1.01±0.18， t＝7.90， P<0.05)；蛋白表达水平亦显著低于对照组(αv：0.45±0.03比0.88±0.06， t＝10.33， P<0.05；β3：0.48±0.09比1.10±0.11， t＝9.02， P<0.05)。iRGD-exos-si-av/β3与空载外泌体组分别与8505C细胞共孵育后，前者mRNA水平表达明显低于空载组(αv：0.30±0.08比1.05±0.02， t＝16.75， P<0.05；β3：0.27±0.05比1.29±0.20， t＝8.71， P<0.05)；蛋白水平表达亦低于对照组(αv：0.60±0.30比1.20±0.23， t＝5.72， P<0.05；β3：0.24±0.11比1.26±0.14， t＝16.23， P<0.05)。载si-αv/β3的靶向外泌体组的细胞增殖率在不同时间点均明显低于空载组[载si-αv组：12 h，(1.84±0.34)%比(3.86±0.47)%， t＝6.07， P<0.05；24 h，(2.70±0.28)%比(6.52±0.29)%， t＝15.99， P<0.05；48 h，(3.62±0.25)%比(8.93±0.15)%， t＝31.16， P<0.05；载si-β3组：12 h，(2.07±0.15)%比(3.86±0.15)%， t＝6.35， P<0.05；24 h，(3.48±0.10)%比(6.52±0.29)%， t＝16.98， P<0.05；48 h，(3.85±0.22)%比(8.90±0.15)%， t＝32.62， P<0.05]。划痕24 h和48 h载si-αv/β3的靶向外泌体组的细胞迁移率均低于空载组[24 h：载si-αv组为(13.00±1.10)%比(36.00±4.00)%， t＝9.60， P<0.01；载si-β3组为(7.00±1.60)%比(36.00±4.00)%， t＝11.34， P<0.01；48 h：载si-αv组为(17.00±1.20)%比(65.00±2.50)%， t＝28.89， P<0.01；载si-β3组为(22.00±1.80)%比(65.00±2.50)%， t＝24.01， P<0.01]。载si-αv/β3组的细胞迁移数均低于空载组[载si-αv组：(3 361.67±860.52)个比(7 620.67±1 008.46)个， t＝5.56， P<0.05；载si-β3组：(2 868.33±1 499.92)个比(7 620.67±1 008.46)个， t＝4.55， P<0.01]。 结论:iRGD靶向外泌体运载si-αv/β3通过下调ATC细胞中整合素αv/β3的表达有效减弱其增殖、迁移和侵袭能力。

目的:探讨环状RNA(circRNA）＿0128846对人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞放射抵抗的影响及机制。方法:应用GEO数据库筛选、采用荧光实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测在人NSCLC细胞A549及其放射抵抗细胞（A549R）中差异表达最显著的circRNA作为目标circRNA，qRT-PCR检测其在人支气管上皮细胞Beas-2B及人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975中的表达水平。在A549细胞中转染目标circRNA过表达载体，在A549R细胞中转染目标circRNA沉默载体，并检测以上细胞经8 Gy X射线照射后的克隆形成能力。应用人类环状RNA数据库和circinteractome数据库预测目标circRNA下游的miRNA，qRT-PCR检测A549R细胞中目标circRNA沉默后表达水平上升最显著的miRNA作为目标miRNA。qRT-PCR检测A549细胞中过表达目标circRNA后目标miRNA的表达情况；通过双荧光素酶报告基因分析人胚肾细胞293T中过表达目标miRNA后目标circRNA的表达情况；qRT-PCR检测目标miRNA在A549、A549R细胞中的表达水平。在A549细胞中转染目标miRNA抑制剂以沉默目标miRNA，在A549R细胞中转染目标miRNA模拟物以过表达目标miRNA，并检测以上细胞经8 Gy X射线照射后的克隆形成能力；将过表达目标circRNA的A549细胞进行8 Gy X射线照射并在该细胞中过表达目标miRNA，检测细胞的克隆形成能力。组间数据的比较采用独立样本 t检验。 结果:qRT-PCR检测结果显示，circRNA_0128846为目标circRNA，且其在人NSCLC细胞A549、H460、H1299、H1975中的相对表达水平均高于人支气管上皮细胞Beas-2B（ t=6.200、7.903、6.010、6.132，均 P<0.01）。过表达circRNA_0128846的A549细胞经照射后的克隆形成能力增强（0.22%对0.45%， t=4.427， P<0.05）；沉默circRNA_0128846后A549R细胞经照射后的克隆形成能力降低（0.23%对0.10%， t=3.780， P<0.05）。qRT-PCR检测结果显示，miR-1183为目标miRNA，在A549细胞中过表达circRNA_0128846显著下调miR-1183的表达（ t=6.002， P<0.01）；双荧光素酶报告基因分析证实过表达miR-1183可显著下调circRNA_0128846的表达（ t=4.562， P<0.05）；miR-1183在A549R细胞中的相对表达水平显著低于亲本A549细胞（ t=6.025， P<0.01）。过表达miR-1183显著降低A549R细胞经照射后的克隆形成能力，沉默miR-1183显著增强A549细胞经照射后的克隆形成能力（0.26%对0.15%、0.21%对0.31%， t=3.671、3.293，均 P<0.05），且过表达miR-1183显著降低了过表达circRNA_0128846对A549细胞克隆形成能力的促进作用（1.90%对1.20%， t=6.325， P<0.01）。 结论:circRNA_0128846作为miR-1183的吸附海绵，可抑制miR-1183的表达进而抑制其放疗增敏作用，从而促进人NSCLC细胞的放射抵抗。

目的:报道国内ABCD1基因c.332T>G（p.V111G）新发位点突变家系，探讨其临床特征和分子机制。方法:对2017年5月就诊于郑州大学第一附属医院的1例中年起病患者的临床资料、实验室检查及影像学检查结果进行总结分析，作出临床诊断。通过高通量测序检测该患者的基因突变，并通过Sanger测序验证该患者家族成员中是否存在相同突变。通过蛋白结构预测及致病性分析探讨该突变的致病性。构建肾上腺脑白质营养不良蛋白-绿色荧光蛋白（ALDP-GFP）及ALDP-GFP（V111G）质粒并转染人胚肾293细胞，通过免疫荧光及蛋白免疫印迹分析方法探究该突变的分子机制（在河南省人民医院完成）。结果:先证者为39岁男性，确诊为X-连锁肾上腺脑白质营养不良的肾上腺脊髓神经病型，携带ABCD1基因新的杂合错义突变c.332T>G（p.V111G），其母亲和2个女儿均为携带者。蛋白结构预测及致病性分析结果提示该突变具有致病性。在HEK293细胞系中过表达ALDP-GFP（V111G）可导致ALDP的表达量显著降低并伴有从过氧化物酶体膜向细胞质的异常定位改变，及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的显著下调。结论:c.332T>G（p.V111G）是ABCD1基因的一个新的致病性突变，通过影响自噬导致肾上腺脊髓神经病型的发生。

目的:观察白细胞介素（interleukin，IL）-37在糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）患者中的表达，并评估外源性IL-37对DKD患者CD8 +T细胞功能的调控作用。 方法:采用横断面研究方法，纳入20例健康对照者、36例2型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）患者及47例DKD患者。采集外周血，分离血浆和外周血单个核细胞。酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血浆IL-37、可溶型IL-1受体8（IL-1 receptor 8，IL-1R8）水平。流式细胞术检测CD8 +T细胞中IL-18受体α链（IL-18 receptor α chain，IL-18Rα）、IL-1R8水平和免疫检查点分子水平。纯化CD8 +T细胞，使用重组IL-37刺激培养，与人胚胎肾293（human embryonic kidney 293，HEK293）细胞直接接触或间接接触共培养。ELISA法检测穿孔素（perforin）、颗粒酶B（granzyme B）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。通过检测乳酸脱氢酶水平计算靶细胞死亡比例。 结果:DKD患者血浆IL-37水平［（63.42±23.30）ng/L］低于健康对照者［（143.02±50.67）ng/L］和TD2M患者［（87.88±40.62）ng/L］（ t=8.848， P<0.001； t=3.456， P<0.001）。血浆IL-37对个体发生T2DM、T2DM患者发生DKD的预测效能较好［曲线下面积分别为0.797（95% CI 0.676～0.917， P<0.001）和0.691（95% CI 0.576～0.807， P=0.003）］。DKD患者血浆IL-37水平与血尿素氮（ r=-0.313， P=0.032）和血肌酐水平（ r=-0.477， P<0.001）呈负相关，与估算肾小球滤过率呈正相关（ r s=0.478， P<0.001）。DKD患者IL-1R8 + CD8 +细胞比例显著高于健康对照者和T2DM患者（33.60%±9.47%比16.29%±5.97%、17.13%±4.85%， t=7.545、9.516，均 P<0.001），且与空腹血糖、血尿素氮、血肌酐、估算肾小球滤过率无相关性（均 P>0.05）。IL-18Rα + CD8 +细胞比例、可溶型IL-1R8水平、免疫检查点分子占CD8 +T细胞比例在健康对照者、T2DM患者、DKD患者之间的差异无统计学意义（均 P>0.05）。DKD患者CD8 +T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B水平均显著高于健康对照者［（108.78±12.42）ng/L比（94.60±10.07）ng/L， t=3.096， P=0.005；（261.34±48.79）ng/L比（166.28±30.80）ng/L， t=3.387， P=0.002］和T2DM患者［（108.78±12.42）ng/L比（92.58±14.71）ng/L， t=3.263， P=0.003；（261.34±48.79）ng/L比（170.66±39.24）ng/L， t=2.627， P=0.014］，但CD8 +T细胞分泌IFN-γ和TNF-α水平在健康对照者、T2DM患者、DKD患者间的差异无统计学意义（均 P>0.05）。在直接接触共培养中，IL-37刺激后CD8 +T细胞诱导HEK293细胞死亡比例降低（13.03%±4.97%比17.88%±5.19%， t=2.235， P=0.037），上清中穿孔素［（222.02±25.79）ng/L比（294.30±25.58）ng/L， t=6.603， P<0.001］、颗粒酶B［（416.27±90.24）ng/L比（524.71±115.53）ng/L， t=2.454， P=0.023］、IFN-γ［（23.66±4.20）ng/L比（35.18±8.51）ng/L， t=4.026， P<0.001］和TNF-α［（1.62±0.29）μg/L比（2.09±0.57）μg/L， t=2.302， P=0.034］水平均降低。在间接接触共培养中，CD8 +T细胞诱导HEK293细胞死亡比例、穿孔素、颗粒酶B水平在无刺激和IL-37刺激之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05），但IL-37刺激后上清中IFN-γ［（23.56±6.24）ng/L比（32.56±9.90）ng/L， t=2.550， P=0.019］和TNF-α［（1.41±0.31）μg/L比（2.10±0.44）μg/L， t=4.011， P<0.001］水平降低。 结论:DKD患者外周血IL-37水平降低，外源性IL-37可抑制DKD患者CD8 +T细胞的杀伤活性。

目的:研究巨结肠家系RET基因新发无义突变c.2599G>T是否具有致病功能。方法:利用定点突变技术构建RET c.2599G>T突变型过表达腺病毒，感染人胚肾细胞HEK-293。实验分为4组：未感染组(Control组)、阴性对照腺病毒对照组(NC组)、RET野生型过表达腺病毒组(WT组)、RET c.2599G>T突变型过表达腺病毒组(c.2599G>T组)。利用RT-PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光定位、Transwell迁移实验、CCK-8增殖实验、流式细胞凋亡检测技术，胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor，GDNF)处理细胞后检测p-RET和p-ERK1/2，探究突变RET基因的功能。多组均数间比较采用Tukey's T检验，多个研究组均数与对照组均数比较采用Dunnett- T检验。 结果:c.2599G>T组不能检测到RET全长蛋白。Transwell检测细胞迁移个数c.2599G>T组(100.80±14.72)较WT组(155.20±7.89)迁移能力下降( P<0.001)。CCK-8检测细胞增殖能力c.2599G>T组比WT组分别在24 h (0.68±0.06比0.83±0.10)、48 h(0.90±0.10比1.17±0.13)、72 h(1.07±0.11比1.401±0.19)和96 h(1.38±0.12比1.68±0.15)明显下降( P<0.05)。流式细胞技术检测凋亡，c.2599G>T组3.12%较WT组0.85%增加( P<0.001)。应用GDNF处理细胞后，蛋白质印迹法检测p-RET和p-ERK1/2蛋白表达，c.2599G>T组(0.79±0.02，5.60±0.02)较WT组(72.04±0.58，10.72±0.02)均明显下降( P<0.001)。 结论:RET基因无义突变c.2599G>T，是具有功能的新发突变，具有致病性，对先天性巨结肠的遗传咨询具有指导意义。

目的:构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)沉默子的荧光素酶报告质粒，在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性，生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法:通过PCR扩增人STING-5-1a(-124～+267，相对于转录起始位点，TSS: 0)和STING-5-2a(-124～+168)区域，亚克隆至pGL3-Basic质粒；将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169～+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative)，并把STING-5-1b分为两段互补片段，亚克隆至pGL3-Control载体上，命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169～+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210～+267)，双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点，将预测结合位点进行多点突变，检测荧光素酶活性。敲低转录因子，免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果:核酸测序证实，上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169～+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时，与pGL3-Control质粒相比，pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降( P<0.05)，其中，STING-5-1b-β(+210～+267)序列起主要抑制作用。应用生物信息学软件预测发现转录因子PR结构域锌指蛋白4(PRDM4)、Thanatos相关蛋白1(THAP1)、TEA域转录因子1(TEAD1)、核受体亚家族4 A组成员1(NR4A1)、类Krueppel因子4(KLF4)和叉头转录蛋白O3(FOXO3)可能与人STING沉默子区域(+210～+267)结合。对上述转录因子的结合位点进行多点突变构建突变体并转染至HEK293T和HeLa，发现THAP1-Mut和TEAD1-Mut的相对荧光素酶活性显著上升，提示STING沉默子可能含有THAP1和TEAD1的结合位点。将转录因子THAP1和TEAD1敲低后，STING的表达水平有显著上升。染色体免疫共沉淀试验表明，转录因子TEAD1和THAP1在细胞内与人STING沉默子区域结合。 结论:本实验成功构建了人STING沉默子荧光素酶报告质粒，通过活性比较，推测人STING的核心沉默子区位于+210～+267区域，通过生物信息学分析及点突变实验初步确定人STING沉默子可能含有的潜在转录因子结合位点。并使用免疫印迹试验和染色体免疫共沉淀进一步证实转录因子TEAD1和THAP1与人STING沉默子的结合，为后续研究提供实验资料。

目的:评价 68Ga－1，4，7，10－四氮杂环十二烷－1，4，7，10－四乙酸(DOTA)－丝氨酸－天冬酰胺－苏氨酸－精氨酸－缬氨酸－丙氨酸－脯氨酸(SNTRVAP，简称VAP)分子探针在体内外靶向葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的特异性以及用于GRP78阳性肿瘤microPET/CT诊断的可行性。 方法:将多肽VAP与双功能螯合剂DOTA偶联后进行 68Ga标记，制备 68Ga－DOTA－VAP分子探针。用蛋白免疫印迹法验证人脑胶质瘤细胞株U87MG、人胰腺癌细胞株BxPC－3、人胚胎肾细胞株293T细胞中GRP78表达情况，并用阻断实验验证 68Ga－DOTA－VAP与上述细胞的特异性结合。建立U87MG与BxPC－3荷瘤裸鼠模型，检测 68Ga－DOTA－VAP在体内的生物学分布；用microPET/CT评价 68Ga－DOTA－VAP在U87MG与BxPC－3荷瘤裸鼠模型的显像效果。采用两独立样本 t检验、单因素方差分析和Dunnett t检验分析数据。 结果:68Ga－DOTA－VAP制备简便，标记率、放化纯均大于98%，体外稳定性好，2 h后放化纯仍为(98.27±0.22)%。GRP78在U87MG、BxPC－3和293T细胞中均有表达(分别为0.78±0.02、0.53±0.05和0.36±0.03)，且在肿瘤细胞中的表达高于正常细胞( F＝102.22， P<0.001； t值：0.43、0.18，均 P<0.01)。U87MG细胞对 68Ga－DOTA－VAP的摄取高于BxPC－3细胞(5 154.00±216.70和4 344.00±60.88； t＝3.10， P＝0.027)，过量VAP多肽可显著降低U87MG、BxPC－3细胞对探针的摄取(3 324.00±54.14、3 270.00±131.10； t值：8.19、7.43，均 P<0.01)。 68Ga－DOTA－VAP经尾静脉注射后，在U87MG肿瘤组织的摄取高于BxPC－3肿瘤组织[(1.98±0.20)和(1.30±0.08)每克组织百分注射剂量率(%ID/g)； t＝5.48， P＝0.005]；注射过量VAP多肽后，肿瘤组织摄取显著降低[(0.99±0.02)和(0.62±0.05) %ID/g； t值：8.32、12.25，均 P<0.05]。MicroPET/CT显像示U87MG、BxPC－3模型鼠肿瘤清晰可见，U87MG模型鼠显影效果更佳；注射过量VAP多肽后，2种模型鼠肿瘤显像均不明显。 结论:68Ga－DOTA－VAP分子探针可与GRP78特异性结合，其可反映体内GRP78表达水平并有希望用于GRP78阳性肿瘤的特异性显像诊断。

目的:探讨胃癌患者血清外泌体对胃癌细胞AGS顺铂耐药、克隆形成、迁移、侵袭和凋亡的影响，并探讨其分子机制。方法:分离胃癌患者血清外泌体，qRT-PCR检测血清外泌体中lncRNA HOTTIP的表达。体外培养正常胃上皮细胞株GES1、胃癌细胞株AGS、人胚肾细胞株293T。AGS细胞与外泌体（Exo）孵育，以PBS处理作为对照，随后转染si-NC或si-HOTTIP-3，设为Exo组、PBS组、si-NC+Exo组、si-HOTTIP-3+Exo组。AGS细胞分别转染si-NC、si-HOTTIP-1、si-HOTTIP-2、si-HOTTIP-3、oe-HOTTIP、vector、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic、oe-HOTTIP+mimic NC、miR-138-5p inhibitor、inhibitor NC、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1及miR-138-5p inhibitor+si-NC，设为si-NC组、si-HOTTIP-1组、si-HOTTIP-2组、si-HOTTIP-3组、oe-HOTTIP组、vector组、oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组、oe-HOTTIP+mimic NC组、miR-138-5p inhibitor组、inhibitor NC组、miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组及miR-138-5p inhibitor+si-NC组。293T细胞转染mimic NC+HOTTIP wt、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt、mimic NC+HOTTIP mut、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut、mimic NC+TJP1 3'UTR wt、miR-138-5p mimic+TJP1 3'UTR wt、mimic NC+TJP1 3'UTR mut、miR-138-5p mimic+TJP1 3'UTR mut分别设为mimic NC+HOTTIP wt组、miR-138-5p mimic+HOTTIP wt组、mimic NC+HOTTIP mut组、miR-138-5p mimic+HOTTIP mut组、mimic NC+TJP1 3'UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP1 3'UTR wt组、mimic NC+TJP1 3'UTR mut组、miR-138-5p mimic+TJP1 3'UTR mut组。CCK8实验检测细胞的顺铂敏感性，平板克隆检测细胞克隆形成，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot实验检测外泌体标志蛋白CD63和CD81、TJP1及耐药相关蛋白P-gp、MCL-1的表达，双荧光素酶实验验证lncRNA HOTTIP、miR-138-5p和TJP1之间的靶向关系。观察指标：（1）lncRNA HOTTIP的表达情况。（2）血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。（3）过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。（4）miR-138-5p靶向TJP1 3′非编码区检测情况。（5）抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。正态分布的计量资料以 x±s表示，组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey′s检验。计数资料以绝对数表示，组间比较采用 χ2检验。相关性分析采用Pearson检验。 结果:（1）lncRNA HOTTIP的表达情况。lncRNA HOTTIP在胃癌患者血清外泌体中的表达高于在健康志愿者血清外泌体中的表达，差异有统计学意义（ P<0.05）。透射电子显微镜结果显示：血清外泌体呈圆形或卵圆形；Western blot检测结果显示：血清外泌体中存在标志性蛋白CD63和CD81的表达。（2）血清外泌体介导lncRNA HOTTIP对胃癌细胞顺铂的耐药情况。与PBS组比较，Exo组半抑制浓度（IC50）、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高，细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与si-NC+Exo组比较，si-HOTTIP-3+Exo组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。（3）过表达lncRNA HOTTIP通过miR-138-5p对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与vector组比较，oe-HOTTIP组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高，细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与oe-HOTTIP+mimic NC组比较，oe-HOTTIP+miR-138-5p mimic组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。（4）miR-138-5p靶向TJP1 3′非编码区检测情况。双荧光素酶实验显示：mimic NC+TJP1 3′UTR wt组、miR-138-5p mimic+TJP1 3′UTR wt组的荧光素酶活性分别为1.00±0.09、0.21±0.03，差异有统计学意义（ t=15.02， P<0.05）。（5）抑制miR-138-5p通过TJP1对胃癌细胞顺铂耐药的调控情况。与inhibitor NC组比较，miR-138-5p inhibitor组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均升高，细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与miR-138-5p inhibitor+si-NC组比较，miR-138-5p inhibitor+si-TJP1组IC50、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、迁移细胞数、P-gp蛋白表达和MCL-1蛋白表达均降低，细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:血清外泌体介导lncRNA HOTTIP通过调控胃癌细胞中miR-138-5p/TJP1的表达，促进胃癌细胞的顺铂耐药性、克隆形成、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡。

目的:分析Ⅰ型Bartter综合征患儿SLC12A1基因变异的功能特性，探索分子伴侣类药物4-苯丁酸钠对SLC12A1基因变异体的纠正作用。方法:回顾性分析2017至2018年南京医科大学附属儿童医院收治的3例Ⅰ型Bartter综合征患儿的临床表现、生长发育情况、实验室检查结果及SLC12A1基因变异情况等，在人胚胎肾293细胞（HEK293）中分别过表达野生型和变异型SLC12A1基因，运用蛋白免疫印迹法检测各组Na +-K +-2Cl -共同转运体（NKCC2）的表达水平，免疫荧光技术检测NKCC2的亚细胞定位，同时用分子伴侣类药物4-苯丁酸钠处理转染SLC12A1基因变异体的细胞，运用非配对 t检验比较处理前后药物对变异体的纠正作用。 结果:3例患儿中男2例、女1例，分别为3.0、4.0、1.2岁。均表现为早产，母亲孕期羊水多，生后出现低氯性碱中毒，伴低钾、低钠血症等。一代测序结果显示3例患儿为SLC12A1基因纯合或复合杂合型变异。在HEK293细胞中发现3种变异体NKCC2（p.L463S、p.L479V和p.507-510del）膜蛋白表达均低于野生型（0.718±0.039、0.287±0.081、0.025±0.156比1.001±0.028， t=5.92、8.35、30.49，均 P<0.01），p.L479V和p.507-510del总蛋白表达均低于野生型（0.630±0.032、0.043±0.003比1.000±0.111， t=3.21、8.65，均 P<0.05）。4-苯丁酸钠处理组p.L463S、p.L479V成熟型蛋白表达水平均高于未处理组（0.459±0.018比1.123±0.024、0.053±0.012比1.256±0.037， t=2.75、18.35，均 P<0.05）。免疫荧光实验示p.L479V和p.507-510del 2种变异体滞留于细胞质内，且4-PBA可以促进p.L479V变异体转运到细胞膜上。 结论:SLC12A1基因3种变异体导致蛋白表达或定位异常，4-苯丁酸钠可在一定程度上纠正Ⅰ型Bartter综合征患儿SLC12A1基因变异体的表达和定位缺陷，可能为临床治疗Ⅰ型Bartter综合征提供新的治疗靶点。