目的:探讨腺苷酸活化蛋白激酶亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2，Prkaa2）与核糖体蛋白S6激酶A1 （ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）的关系及Prkaa2对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β，TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞纤维化的影响。方法:用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e细胞制备纤维化的细胞模型。采用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、蛋白质印迹法检测大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52e细胞（对照组）和10 ng/ml TGF-β1诱导12、24、36 h的NRK-52e细胞中Prkaa2的表达水平。于NRK-52e贴壁生长达30%时加入Prkaa2低表达慢病毒，转染72 h后收集细胞，并于Prkka2低表达慢病毒组及Prkaa2空病毒组中用qRT-PCR检测Prkaa2敲减效率。设立TGF-β1诱导、Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导3个实验组，同时以正常未作任何处理的NRK-52e细胞系为对照组。通过蛋白质印迹法检测Prkaa1、Prkaa2、α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、E钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase9，Caspase9）和p53基因（p53）的表达。从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组中分别选取3个生物学重复样本，通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选差异表达的基因。然后，在Prkaa2RNAi+TGF-β1、Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导2个实验组中验证Prkaa2、Rps6ka1的表达。结果:qRT-PCR及蛋白印迹检测结果显示，TGF-β1诱导12 h时NRK-52e细胞中Prkaa2的mRNA和蛋白的相对表达量分别为1. 368±0. 083和1. 311±0. 007，与对照组1. 000±0. 123和1. 159±0. 009相比，差异有统计学意义（ P<0. 05）。qRT-PCR实验结果显示Prkaa2空病毒组相对表达量为1. 042± 0. 302，较Prkaa2低表达慢病毒组为0. 171±0. 165 ，Prkaa2 mRNA表达下调，差异具有统计学意义（ P= 0. 023）。蛋白质印迹法检测结果显示，TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为2. 89±0. 04，较对照组3. 82±0. 03下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 04±0. 04，较对照组1. 06±0. 05未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；TGF-β1诱导组α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为3. 60±0. 03、1. 07±0. 07、1. 81±0. 02、1. 17±0. 04、0. 62± 0. 01，均较对照组2. 95±0. 04、0. 74±0. 03、1. 00±0. 04、0. 77±0. 05、0. 37±0. 01上调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为3. 57±0. 03，较空病毒+ TGF-β1诱导组3. 04±0. 15上调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 03±0. 05，较空病毒+TGF-β1诱导组1. 05±0. 06未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa2、α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为0. 54±0. 02、3. 21±0. 07、0. 44±0. 03、1. 16±0. 08、0. 94±0. 03、0. 44±0. 03，均较空病毒+TGF-β1诱导组0. 89±0. 01、3. 49±0. 06、0. 98±0. 07、1. 87±0. 02、1. 21±0. 04、0. 65± 0. 03下调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Affymetrix基因表达谱芯片测序结果显示核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）下调。蛋白质印迹法和qRT-PCR验证结果提示，Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Rps6ka1表达相对表达量为0. 60±0. 02、0. 590±0. 026，较Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组1. 15±0. 04、1. 003±0. 080下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）。 结论:Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系，抑制Prkaa2可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

目的:探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）抑制剂联合白细胞介素1β（IL-1β）抑制剂对同源重组修复缺陷（HRD）阴性卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的抑制作用。方法:（1）使用HRD阴性的卵巢癌细胞系OVCAR3、CAOV3细胞，先分别给予PARP抑制剂奥拉帕利（122 μmol/L）和二甲基亚砜（作为对照）处理OVCAR3细胞，RNA测序及筛选差异表达基因；随后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白印迹（western blot）法验证奥拉帕利处理后OVCAR3、CAOV3细胞中IL-1β蛋白的表达。（2）根据不同浓度（0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L）IL-1β抑制剂diacerein（为蒽醌类化合物）在OVCAR3和CAOV3细胞中的药物剂量反应曲线，确定两种细胞IL-1β抑制剂的50%抑制浓度（IC 50）。细胞实验分为4组，对照组、奥拉帕利组、IL-1β抑制剂组、奥拉帕利+IL-1β抑制剂组，活细胞计数（CCK-8）法检测4组OVCAR3、CAOV3细胞的存活率。（3）将稳定表达荧光素酶基因luciferase的OVCAR3细胞（OVCAR3-Luc细胞）按照1×10 7个/只接种于裸鼠腹腔中，建立裸鼠腹腔移植瘤模型。动物实验将16只成瘤裸鼠采用随机表法随机分为4组，对照组、奥拉帕利组、IL-1β抑制剂组、奥拉帕利+IL-1β抑制剂组，每组4只。采用荧光素酶小动物活体成像测定4组裸鼠移植瘤的荧光信号强度，免疫组化法检测移植瘤组织中增殖相关核抗原（Ki-67）蛋白的表达。（4）药物毒副反应：腹腔注射后第29天，裸鼠称重后取其外周血进行血常规和肝肾功能检测；随后处死裸鼠，取裸鼠重要器官进行HE染色评估药物对器官的损害情况。 结果:（1）RNA测序及差异表达基因筛选，共获得25个显著差异表达基因，尤以IL-1β mRNA的表达差异最显著。ELISA法检测显示，奥拉帕利处理后OVCAR3、CAOV3细胞分泌的IL-1β蛋白含量分别为（36.2±3.5）和（49.5±3.5）pg/ml，均显著高于对照OVCAR3、CAOV3细胞［分别为（5.3±0.7）和（14.7±0.7）pg/ml； P均<0.001］；western blot检测显示，奥拉帕利处理后OVCAR3和CAOV3细胞中IL-1β蛋白的相对表达水平分别为2.87±0.37、2.05±0.08，均显著高于对照OVCAR3、CAOV3细胞（均设为1.00； P均<0.001）。（2）剂量反应曲线确定IL-1β抑制剂在OVCAR3细胞中的IC 50为75 μmol/L，CAOV3细胞中为100 μmol/L。CCK-8法检测显示，对照组、奥拉帕利组、IL-1β抑制剂组、奥拉帕利+IL-1β抑制剂组OVCAR3细胞的存活率分别为（100.0±0.4）%、（63.1±6.2）%、（61.6±4.7）%、（32.9±5.2）%，CAOV3细胞分别为（100.0±3.5）%、（63.3±3.8）%、（63.8±3.5）%、（30.0±1.3）%，奥拉帕利+IL-1β抑制剂组OVCAR3、CAOV3细胞的存活率均低于对照组、奥拉帕利组、IL-1β抑制剂组（ P均<0.01）。（3）腹腔注射后第29天，荧光素酶小动物活体成像显示，奥拉帕利+IL-1β抑制剂组裸鼠移植瘤的荧光信号强度为（0.5±0.4）×10 10 p/s，显著低于对照组［（4.2±1.0）×10 10 p/s］、奥拉帕利组［（3.1±0.9）×10 10 p/s］、IL-1β抑制剂组［（2.2±0.9）×10 10 p/s； P均<0.05］；奥拉帕利+IL-1β抑制剂组裸鼠瘤重为（0.09±0.03）g，显著低于对照组［（0.25±0.05）g］、奥拉帕利组［（0.17±0.03）g］、IL-1β抑制剂组［（0.19±0.04）g； P均<0.05］。免疫组化法检测显示，奥拉帕利+IL-1β抑制剂组裸鼠移植瘤组织中Ki-67蛋白的表达水平为0.33±0.10，显著低于对照组（1.00±0.20）、奥拉帕利组（0.76±0.07）、IL-1β抑制剂组（0.77±0.12； P均<0.05）。（4）药物毒副反应：腹腔注射后第29天，奥拉帕利+IL-1β抑制剂组裸鼠的体重、血常规和肝肾功能，分别与对照组、奥拉帕利组、IL-1β抑制剂组比较，差异均无明显统计学意义（ P均>0.05）。重要器官包括心、肝、脾、肺和肾，镜下观察均未见明显致死性损害。 结论:PARP抑制剂奥拉帕利联合IL-1β抑制剂在HRD阴性的卵巢癌细胞中显示出显著的肿瘤抑制作用，且无明显的药物毒副反应。

目的:筛选血浆外泌体微小核糖核苷酸(microRNA)作为肝细胞癌(HCC)的诊断标志物，并分析候选miRNA在HCC进展中可能发挥的作用。方法:2018年10月至2019年2月收集12例于广州市第一人民医院初诊为"HCC"的患者及12例健康志愿者血浆样本，利用超速离心法收集血浆外泌体，经动态光散射法及蛋白质免疫印迹法鉴定后，提取RNA进行测序。通过定量聚合酶链反应(qPCR)验证候选外泌体miRNA差异表达量，使用 t检验分析各miRNA表达量差异。通过生物信息学方法预测候选miRNA的靶基因及可能调控的通路，分析其在HCC进展过程中发挥的作用，组间比较采用 t检验。 结果:以差异表达倍数2倍以上(Fold change>2.0或<0.5，且 P<0.05)作为标准，分别比较HCC患者术前、术后及健康志愿者血浆外泌体miRNA的差异表达结果，结合两次结果，筛选表达同时上/下调miRNA共12个。其中，表达上调6个(miR-2115-3p、miR-214-3p、miR-511-5p、miR-1299、miR-10a-5p、miR-375-3p)，表达下调6个(miR-219a-2-3p、miR-127-3p、miR-9-5p、miR-383-5p、miR-212-5p、miR-1248)。qPCR验证候选miRNA在HCC患者及健康志愿者血浆外泌体中的表达差异，HCC组miR-1248表达低于健康志愿者组(9.046 ΔCt比7.597 ΔCt， t＝2.849， P<0.05)。 结论:血浆外泌体miR-1248有作为HCC的诊断标志物的潜力。血浆外泌体miR-1248可通过调控受体细胞的细胞外基质受体相互作用、介导代谢重编程抑制HCC进展。

基于"肠-肝轴"研究逍遥散加味方对代谢相关性脂肪性肝病(MAFLD)小鼠肠黏膜屏障和肠道菌群的影响,探讨其作用.雄性C57BL/6 小鼠随机分成正常组,模型组,双歧杆菌四联活菌片组,逍遥散加味方低、中、高剂量组,每组 10 只.除正常组外,其余组给予高脂饲料诱导MAFLD模型并予不同剂量药物干预,共 12 周.检测小鼠体质量、肝湿重、肝指数;生化试剂盒检测血清天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、脂多糖(LPS)的水平及肝脏肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量;苏木素-伊红(HE)染色和油红O染色观察肝脏、回肠及结肠组织形态;爱先蓝-糖原(AB-PAS)染色检测回肠组织杯状细胞数量;免疫组化和蛋白免疫印迹检测回肠、结肠组织紧密连接蛋白 1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、封密蛋白 1(claudin-1)的表达;16S核糖体RNA(16S rRNA)基因测序分析小鼠肠道菌群变化.结果显示,与正常组相比,模型组小鼠体质量、肝湿重、肝指数均升高;血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C和LPS含量均升高,HDL-C降低;肝组织IL-6、TNF-α含量均升高,肝脏脂质蓄积增多,表明模型诱导成功.与模型组相比,逍遥散加味方中、高剂量组和双歧杆菌四联活菌片组小鼠体质量、肝湿重、肝指数均降低;逍遥散加味方中剂量组和双歧杆菌四联活菌片组小鼠血清TC、TG、LDL-C和ALT、AST水平均显著下降,HDL-C水平显著升高;逍遥散加味方低、中剂量组和双歧杆菌四联活菌片组小鼠肝脏炎症因子IL-6、TNF-α和血清中LPS水平均显著降低,claudin-1、occludin和ZO-1蛋白表达均显著升高.肠道菌群分析显示,与模型组比较,逍遥散加味方中剂量能显著提高小鼠肠道菌群的丰富度和多样性;在门水平上,降低厚壁菌门/拟杆菌门比值;在属水平上,升高乳杆菌属、布劳特菌属、拟杆菌属和阿克曼菌属,降低普雷沃菌属、苏黎世杆菌属和脱硫弧菌属,差异物种以拟杆菌科 Odorbacteraceaae 和消化链球菌科Peptostreptococcaceae发挥主要作用.总之,逍遥散加味方可通过抑制炎症、调节肠道菌群稳态以及促进肠黏膜屏障的修复来治疗MAFLD.

目的 建立症状性颈动脉狭窄及无症状性颈动脉狭窄患者(Exo)微小核糖核酸(miRNA)差异表达谱,并对其进行生物学功能分析.方法 收集2022年12月-2023年1月于河北省人民医院神经内科就诊的4例症状性颈动脉狭窄患者血浆(实验组)和3例无症状性颈动脉狭窄患者血浆(对照组),使用QIAGEN法提取血浆中的Exo,采用透射电子显微镜(TEM)、纳米微粒追踪检测技术(NTA)和蛋白印迹进行鉴定Exo形态、粒径大小以及表面标志蛋白.采用高通量测序技术评估实验组和对照组血浆中Exo miRNAs表达,基于生物信息学进行GO和KEGG通路富集分析.结果 Exo颗粒呈典型圆盘状的囊泡结构,检测到Exo阳性蛋白CD63.症状性颈动脉狭窄患者与无症状性颈动脉狭窄患者相比外泌体中有22个miRNA上调,18个miRNA下调,差异表达的Exo miRNA的靶基因主要在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路等显著富集.结论 本研究发现较对照组相比,症状性颈动脉狭窄患者存在40个差异表达的Exo miRNAs.血浆Exo miRNAs可能通过PI3K-Akt、MAPK、FoxO等信号通路参与颈动脉狭窄的发生发展过程.

目的:从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白.方法:以原核表达、纯化的重组生殖支原体黏附蛋白(rMgPa)为靶分子,对人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库进行4轮生物淘选,采用T7特异性引物扩增阳性克隆的插入片段,PCR产物测序后进行BLAST分析,间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot检测阳性噬菌体与rMgPa的特异结合.结果:经过4轮生物淘选,噬菌体克隆富集明显;DNA测序后经BLAST比对分析,结果表明随机挑取的32个阳性克隆包括7种不同序列,其中以RPL35重复次数最多;间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot结果表明7个代表性噬菌体均能与rMgPa特异结合.结论:60S核糖体蛋白L35(RPL35)可能是MgPa的互作蛋白,为深入了解MgPa的生物学功能以及生殖支原体的致病机制奠定了实验基础.

目的:建立Raptor基因稳定干扰的小鼠胸腺上皮细胞系(mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1).方法:根据Sigma公司数据库Raptor基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,在其3′和5′端添加pLKO.1-puro慢病毒载体酶切位点序列,合成shRNA序列,插入载体.将pLKO.1-puro-shRNA-Raptor慢病毒载体与包装质粒混合,共同转染293T细胞,收集病毒颗粒感染mTEC1,再用嘌呤霉素对其进行筛选,最后用免疫印迹法检测Rap-tor,mTOR,磷酸mTOR(p-mTOR)以及mTOR下游分子核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase,p70S6k),磷酸化p70S6k(p-p70S6k)的表达水平.同时采用细胞计数和TUNEL法分别检测细胞增殖与凋亡.结果:合成的Raptor基因shRNA序列成功插入至经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pLKO.1-puro载体,经测序表明序列正确;免疫印迹结果显示,pLKO.1-puro-shRNA-Raptor感染mTEC1后,Raptor、mTOR及其下游p-p70S6k蛋白表达明显降低,但细胞增殖及凋亡无明显变化.结论:成功构建Raptor shRNA慢病毒表达载体,建立稳定的Raptor基因敲降的小鼠mTEC1.

目的 鉴定刚地弓形虫假定蛋白TGGT1_310420在速殖子阶段的功能及其蛋白N端序列的亚细胞定位作用. 方法 在线设计针对TGGT1 310420的sgRNA,通过定点突变弓形虫CRISPR/Cas9载体pSAG1::CAS9-GFP-U6::sgUPRT上的sgRNA序列获得针对TGGT1_310420的CRISPR/Cas9载体.利用CRISPR/Cas9编辑技术将含有荧光蛋白mCherry和弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的PCR片段mCherry-Ty_HXGPRT插入至TGGT1_310420内源基因编码N端前20个氨基酸残基之后.通过PCR鉴定片段是否正确插入;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析检测融合蛋白的表达情况.间接免疫荧光分析和共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位;空斑实验检测基因缺失株虫体表型的变化. 结果 PCR和测序结果显示,成功构建了针对TGGT1_310420的CRISPR/Cas9载体,mCherry-Ty_HXGPRT序列定点插入至靶点位置.蛋白质印迹分析结果显示,mCherry融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为36 000;间接免疫荧光实验表明mCherry融合蛋白与弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)共定位于虫体的表膜.空斑实验检测结果显示,TrGGT1 _310420的缺失并未引起虫体出现可测的表型变化. 结论 TGGT1_310420编码蛋白前20个氨基酸残基序列具有定位到弓形虫表膜的功能,TGGT1_310420在弓形虫速殖子阶段为非必需基因.

目的 探讨粪菌移植(FMT)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的影响及调控机制.方法 采用随机数字表法将15只大鼠分为对照组、LPS组和LPS+FMT组各5只,LPS组和LPS+FMT组分别腹腔内注射LPS复制大鼠ALI模型,于造模完成24 h后,LPS+FMT组每日给予粪便(10 ml/kg)灌胃2次,对照组和LPS组同时给予等量生理盐水灌胃.干预持续2d,于最后一次FMT24 h后各组分别行动脉血气分析,然后处死大鼠,用酶联免疫吸附法检测血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量,检测肺湿重/肺干重比值(W/D),行肺组织HE染色及病理学评分,免疫组化检测肺泡上皮细胞中的核因子(NF)-κB的核表达和ICAM-1的膜表达,Western印迹法检测胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)信号通路相关蛋白表达.收集大鼠粪便样品并提取DNA,对16S核糖体RNA基因(16SrDNA)的V3、V4区的聚合酶链式反应产物进行高通量测序,并对操作分类单元为分类基础的微生物群落进行生物信息学分析.结果 LPS组W/D、肺组织病理评分均显著高于对照组,而LPS组动脉血氧分压(PaO2)显著低于对照组[(79.2±5.89)比(95.2±2.77)mmHg,1 mmHg=0.133 kPa](均P＜0.05);肠道菌群测序LPS组多样性指数显著高于对照组,而LPS组乳酸杆菌属显著低于对照组;LPS组血清、BALF中ICAM-1含量及其胞膜的相对表达量均显著高于对照组[(8.64±0.87)比(7.40±0.32) ng/L、(0.941±0.035)比(0.739±0.079)ng/L、(0.250±0.010)比(0.076±0.010)](均P＜0.05),且LPS组NF-κB的p-P65、p-PI3K及p-AKT(p代表磷酸化)核蛋白相对表达量均显著高于对照组(4.89±0.27比3.28±0.13、0.265±0.030比0.036±0.013及0.444±0.040比0.109±0.016)(均P＜0.05).FMT后上述损伤效应减轻,LPS+FMT组肺W/D、肺组织病理评分均显著低于LPS组,LPS+FMT组PaO2[(88.0±3.53)mmHg]显著高于LPS组;肠道菌群测序LPS+FMT组多样性指数显著低于LPS组,LPS+FMT组乳酸杆菌属显著高于LPS组;血清、BAL€中ICAM€1含量[(7.44±0.46)、(0.834±0.040)ng/L]及其胞膜的相对表达量(0.173±0.030)以及NF-κB的p-P65、p-PI3K及p-AKT核蛋白相对表达量(2.99±0.28、0.090±0.013、0.206±0.018)均显著低于LPS组(均P＜0.05).结论 FMT可以改善LPS诱导的大鼠ALI,其可能与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路活化、减少炎症因子ICAM-1等表达有关.

[目的]从T7噬菌体展示的结核分枝杆菌基因组DNA文库中筛选结核病阳性血清特异结合蛋白.[方法]以饱和硫酸铵法初步纯化的结核病阳性血清为靶分子,对结核分枝杆菌基因组DNA文库进行3轮生物淘选;PCR扩增阳性噬菌体的外源DNA片段,测序后进行BLAST分析;间接ELISA和斑点免疫印迹试验检测阳性噬菌体与结核病阳性血清能否特异结合.[结果]经过3轮生物淘选,与结核病阳性血清特异结合的噬菌体得到明显富集;BLAST结果表明随机挑取的19个阳性噬菌体包括4种不同的序列,其中编码核糖激酶的序列出现次数最多;这些代表性噬菌体均能与结核病阳性血清特异结合.[结论]成功筛选到能与结核病阳性血清特异结合的4种蛋白,其中核糖激酶可能为与结核病阳性血清特异结合的优势抗原.