[目的]细胞色素P450 家族是十字花科植物硫苷合成重要的酶系,其中CYP83 亚家族主要参与核心结构的合成,旨在探究大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)CYP83B1 基因的功能.[方法]利用RT-PCR技术克隆BrCYP83B1 基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白理化性质、同源性及启动子顺式作用元件,利用RT-qPCR技术分析BrCYP83B1 的表达模式,并构建其植物超表达载体.[结果]BrCYP83B1 cDNA序列全长为 1 500 bp,编码 499 个氨基酸,编码蛋白属于细胞色素P450 超家族,主要定位于细胞质,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,与甘蓝型油菜、青花菜的CYP83B1 蛋白具有较高的同源性.启动子分析表明,该基因启动子区域包含水杨酸、脱落酸及茉莉酸甲酯等激素响应的顺式作用元件,说明BrCYP83B1 基因表达可能受激素调控.RT-qPCR分析结果表明,BrCYP83B1 基因在大白菜的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;茉莉酸甲酯够显著促进该基因的表达,而水杨酸处理对其表达具有一定的抑制作用,脱落酸处理下基因先上调后又下调.[结论]BrCYP83B1可能参与大白菜对激素的响应调控.

[目的]为了探究草珊瑚[Sarcandra glabra(thunb)nakai]不同器官中内源激素对类胡萝卜素差异积累的可能调控机制.[方法]通过代谢组学方法分析草珊瑚中内源激素和类胡萝卜素代谢物在不同器官间的差异分布情况,结合转录组学技术挖掘草珊瑚类胡萝卜素相关差异酶基因,进一步预测参与调控差异酶基因的转录因子及其激素相关顺式响应元件,从而分析内源激素对类胡萝卜素差异积累的可能调控作用.[结果]吲哚-3-羧酸(indole-3-carboxylic acid)、反式茉莉酸[(-)-jasmonic acid]、二氢茉莉酮酸甲酯(ethyl dihydrojasmonate)、油菜素甾酮(castasterone)、油菜素内酯(brassinolide)等 7 种内源激素在叶中的含量更高,与角黄素(canthaxanthin)、海胆酮(echinenone)、新黄质(neoxanthin)和念珠藻黄素(nostoxanthin)等 8 种差异代谢物等富集部位一致;而脱落酸(abscisic acid,ABA)、赤霉素 4,5-甲氧基水杨酸(gibberellin 4,5-methoxysalicylic acid)、二氢茉莉酸(dihydrojasmonic acid)和 5,6-二羟基吲哚(5,6-dihydroxyindole)在根中的含量更高,与脱落酸醛(abscisic aldehyde)、4,4'-二聚戊烯(4,4'-aiapolycopenedial)、花药黄质(antheraxanthin)这 3 种差异代谢物富集部位一致;关键转录因子MYB106、SPL1、NAC015、ERF064、WRKY44、BHLH116 可通过响应AUX、SA、GA、ABA、Me_JA等植物激素的刺激,参与调控类胡萝卜素合成途径的DXS、VDE、ABA2、AOG、ZEP、CYP97C1、DWARF27、CRTISO、LCYB、PSY这 10 种代谢酶的表达.实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)结果表明,随机选取的 8 个差异基因表达趋势与转录组测序结果一致.[结论]筛选出草珊瑚叶和根与类胡萝卜素相关的 15 种差异内源激素与 11 种差异代谢物,预测了 6 种转录因子参与调控 10 种代谢酶.

目的 克隆北柴胡Bupleurem chinense达玛烯二醇合成酶(dammarenediol synthase,DS)基因BcDS,并进行生物信息学及表达模式分析.方法 通过搜索转录组数据库,利用RT-PCR克隆开放阅读框(open reading frame,ORF)和启动子区.通过生物信息在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、结构域、信号肽、三级结构等分子特征,利用Jalview软件进行氨基酸多序列比对,采用MEGA 11.0软件进行分子进化分析.运用实时荧光定量PCR检测基因表达模式.结果 BcDS ORF长2115bp,编码的蛋白包涵704个氨基酸,相对分子质量为80 770,为酸不稳定的亲水蛋白,无跨膜结构域或信号肽.BcDS与人参、西洋参等植物DS的相似性高,具有达玛烯二醇合成酶特征结构域,且BcDS与人参、西洋参、三七等DS聚为一支.BcDS启动子区域含有响应环境及植物激素的顺式作用元件.BcDS在根中的表达量最高,分别为茎、叶和花中BcDS表达量的5.81、10.44和7.86倍,并受茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)和水杨酸(salicylic acid,SA)的显著诱导.结论 获得北柴胡BcDS基因序列特征,明确了 BcDS根中高表达且受MeJA和SA诱导表达,为进一步研究基因在柴胡皂苷合成中的分子作用奠定基础.

天冬氨酸蛋白酶(AP)是一类重要的水解酶,在植物生长发育及抵御生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用.谷子(Setaria italica)作为禾本科C4 植物抗逆研究的模式作物,目前关于天冬氨酸蛋白酶家族基因功能的研究较少.为深入探究AP基因家族在谷子中的功能作用,本研究基于AP保守Pfam序列全基因组筛选鉴定谷子AP基因家族的成员,并通过生物信息学方法对其理化性质、亚细胞定位、基因结构、保守结构域、系统进化发育、启动子顺式作用元件及共线性等分析,同时利用荧光定量PCR技术对其在非生物胁迫下的表达模式进行了研究.结果表明,谷子基因组中共有AP基因家族成员 58 个;系统进化树显示该基因家族可分为 5 个亚家族,其中Group B编码非典型天冬氨酸蛋白酶,其他亚家族编码类nucellin天冬氨酸蛋白酶;基因结构和保守基序分析表明,谷子AP家族同一亚家族成员具有较高的保守性;共线性分析结果显示,谷子AP基因家族与水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)AP基因家族成员之间存在大量的同源基因对;启动子顺式作用元件分析表明,SiAPs基因家族中大部分成员含有与非生物胁迫和生物激素响应相关的顺式元件,如响应干旱和低温胁迫的顺式作用元件、水杨酸有关的应答元件等.进一步RT-qPCR结果发现,SiAPs基因家族成员在谷子根、茎、叶、穗中差异表达;在低温胁迫下,SiAP3、SiAP9、SiAP48 基因表达量显著升高;在干旱胁迫和水杨酸处理下,部分基因表达的变化趋势基本一致.SiAPs对谷子响应非生物胁迫起重要的调控作用,本研究结果可为SiAPs的抗逆功能分析提供参考.

植物生长素早期响应基因GH3编码的酰胺合酶催化生长素、茉莉酸及苯甲酸衍生物与氨基酸结合,形成相应的氨基酸复合物.当植物体内生长素浓度过高时,GH3蛋白催化生长素与氨基酸结合,形成的复合物作为生长素贮存库.当生长素浓度过低时,生长素-氨基酸复合物被蛋白水解酶水解为生长素,重新参与生长素信号通路,从而调控植物体内生长素动态平衡.当植物受到生物或非生物胁迫时,GH3蛋白催化茉莉酸和水杨酸与氨基酸结合,参与植物胁迫响应.该文从GH3蛋白结构、GH3基因家族分类及其生物学功能方面总结了双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、单子叶模式植物水稻(Oryza sativa)及其它植物中GH3基因的研究进展,为植物GH3基因家族的深入研究提供参考.

为探讨扩展蛋白在桉树生长发育中的作用,以在桉树初生生长到次生生长转换转录组测序中筛选出的差异表达基因EgrEXPA8 和EgrEXPA10 为基础,从巨桉(Eucalyptus grandis)中克隆了 2 个扩展蛋白基因EgrEXPA8 和EgrEXPA10,分别编码249和244个氨基酸,属于亲水蛋白,但EgrEXPA8稳定性高于EgrEXPA10.qRT-PCR分析表明,EgrEXPA8和EgrEXPA10基因均在幼叶和茎尖组织中表达量较高,在木质部和韧皮部表达量较低;且在茎顶端初生生长阶段表达量较高,而在下部次生生长节间表达量较低,可能其主要参与巨桉的初生生长或者负调控次生生长;另外在盐胁迫、茉莉酸甲酯处理下其均被抑制表达;而在水杨酸、缺硼、缺磷处理下均上调表达.这说明EgrEXPA8 和EgrEXPA10 在巨桉响应逆境胁迫时起到重要作用,且呈现出相似的调控方式.

该研究以拟南芥抗逆基因At1g67520为探针,利用海岛棉ESTs数据库,通过电子克隆获得海岛棉RLCK家族基因GbRLCK10,解析该基因组结构,并结合qRT-PCR技术分析该基因mRNA的组织表达特征以及在不同胁迫诱导下的表达模式,为揭示RLCK家族基因在海岛棉中的表达调控及作用机制提供理论依据.结果显示:(1)获得海岛棉类受体胞质激酶(RLCK)基因,其开放阅读框(ORF)为1179 bp,编码392个氨基酸,具有典型的Ser-ine/Threonine结构域,属于RLCK家族,与GaRLCK10(XP_017604046.1)亲缘关系较近,命名为GbRLCK10(登录号2022184),且该基因由5个外显子和4个内含子组成.(2)实时荧光定量(qRT-PCR)检测显示,GbRLCK10基因在抗病品种'新海21'和感病品种'新海14'的根、茎、叶中均有表达;当黄萎病菌诱导后,GbRLCK10基因在抗病品种中对于病原菌的响应时间早于感病品种,且对黄萎病菌响应更强烈,推测该基因参与棉花对黄萎病的响应;盐(NaCl)、干旱(PEG-6000)处理'新海21'后,GbRLCK10基因在NaCl处理下响应时间要早于PEG-6000处理,但对PEG-6000处理响应更强烈;分别用4种激素处理'新海21'后,GbRLCK10均能被诱导表达,且在水杨酸(SA)处理后表现为先增加后下降再增加趋势,在乙烯(ET)处理后表达量为持续上升趋势,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理后呈先升高然后下降的趋势,但GbRLCK10基因对赤霉素(GA3)响应不明显.研究表明,GbRLCK10基因具有RLCK基因家族典型特征,该基因随黄萎病菌、NaCl、干旱、激素处理时间推移而发生变化,推测GbRLCK10基因可能参与了棉花对黄萎病菌、N aC l、干旱、激素胁迫的应答反应,但其功能仍需进一步研究.

果胶甲酯酶抑制因子(PMEI)能够抑制果胶甲酯酶(PME)的脱酯化作用,从而调控果胶甲酯酶的活性.本文在桃(Prunus persica)中鉴定出30个PpPME基因家族成员并进行了生物信息学分析,构建进化树发现,其与拟南芥MEI基因家族进化关系较远.对PpPMEI进行蛋白性质分析发现,大多数PpPMEI蛋白存在信号肽,等电点在4.44～10.02之间,亚细胞定位表明多定位于分泌通路.部分PpPME表达模式分析表明,其在花、果实、叶中有表达差异,Prupe.1G118800和Prupe.5G112600在果实发育过程中表达量下降.赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)三种激素处理后,Prupe.5G048900和Prupe.5G112600被GA和ABA诱导表达,Prupe.7G193 700的表达被GA抑制.本文为研究PpPMEI在调控桃的花与果实发育以及激素响应等方面提供参考.

番茄红素环化是类胡萝卜素合成过程中的重要分支点,植物中存在两种番茄红素环化酶LCYB和LCYE.前期研究发现,OfLCYB1、OfLCYE1等基因的差异表达决定了桂花不同品种中类胡萝卜素代谢分支下游产物的含量不同.以'堰虹桂'基因组DNA为模板,通过染色体步移的方法(Genome walking)克隆出OfLCYB和OfLCYE启动子分别为1028 bp和904 bp.通过生物信息学分析发现两个启动子序列包含TATA-box、CAAT-box等基本元件,同时都含有水杨酸响应元件TCA-element,以及一些光响应元件如Sp1、ACE、Box4、G-box等;OfLCYB启动子还包括脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件P-box,OfLCYE启动子包括赤霉素响应元件GARE-motif及热击响应元件HSE.将克隆到的启动子片段与pBI121载体进行重组,构建植物表达载体并转入农杆菌,采用叶盘法侵染烟草叶片进行瞬时表达.结果表明,OfLCYB和OfLCYE启动子片段均具有驱动下游报告基因表达的功能.

目的:探寻一种商陆多糖快速、简捷的测定方法.方法:利用紫外分光光度计,分别采用苯酚-硫酸法测定商陆总糖含量,DNS法测定还原糖含量,用二者的差值作为测得的商陆多糖含量,并从重复性、稳定性、加样回收率等方面进行方法学考察;通过对商陆多糖超声波辅助提取的单因素研究,以多糖提取率为响应值,采用四因素三水平的响应面试验设计进行工艺优化.结果:苯酚-硫酸法联合DNS法测定商陆多糖具有良好的适用性;最佳提取工艺为料液比1∶40(g∶mL)、超声时间30 min、超声温度60℃、超声功率350 W,在此这条件下得到商陆多糖提取率平均为(12.38％±0.59％).结论:本实验采用的样品处理方法简单,测定方法可靠,可用于商陆多糖的测定.