为研究亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742).三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237bp,其5'非编码区(UTR)长度为57 bp,3'非编码区长度为688bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸,CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD.在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39％)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44％)、菲律宾蛤仔(Rudita-pes philippinarum)(78.05％)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66％)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05％).通过SWISS-MODEL预测三角帆蚌CypA含有8个p折叠和2个a螺旋,可能形成CypA的活性中心区域.利用MEGA 5.1软件将三角帆蚌CypA与其他物种CypA基因进行序列比对并构建系统进化树,分析发现三角帆蚌CypA与池蝶蚌的CypA聚为一支,其与池蝶蚌CypA具有最近的亲源关系.通过qRT-PCR检测CypA基因在三角帆蚌不同组织中表达,发现三角帆蚌性腺中CypA基因的表达量最高,肝脏、肾和鳃中的表达量次之.对三角帆蚌浸泡感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),CypA基因在肝脏、性腺、肠和鳃中的表达水平在感染72h先升高后降低,其表达量在性腺和鳃中6h最高,肝脏中12h达到峰值,肠中24h达到最高值,表明三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后,可显著诱导CypA基因的表达.CypA基因在性腺中的表达量到达峰值的时间要早于肠与肝脏,且到达峰值时的相对表达量(14.91)也显著高于肝脏(9.89)、肠(9.78)和鳃(7.53),推测CypA在三角帆蚌性腺中具有防御细菌感染的重要作用,三角帆蚌性腺可能不仅具有生殖的功能,同时在免疫防御系统中也发挥着重要的作用.

为探究热激蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)在应对不利环境胁迫时的作用,研究结合转录组测序和RACE-PCR获得池蝶蚌HSP70家族一个成员(暂命名:HSP70 B2-like)cDNA全长序列(2 209 bp),同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端存在细胞质特异性调控信号EE-MD.与其他物种的HSP70具有很高的相似性.进化树分析表明,获得序列与褶纹冠蚌HSP70亲缘关系最近,并和其他软体动物HSP70 B2亚家族聚为同一进化支.实时荧光定量PCR结果表明,池蝶蚌HSP70 B2-like在检测的多个组织中均有表达,且闭壳肌中表达量最高.经热刺激(37℃)后,池蝶蚌闭壳肌、肝胰腺、外套膜和肾中的HSP70 B2-like mRNA表达快速上调,6 h达到峰值(P＜0.01),随后逐渐下降.池蝶蚌鳃和血细胞中的HSP70 B2-like mRNA表达量则是先降后升再回落.但血细胞、外套膜和肾中的HSP70 B2-like在48 h再次出现表达上调.注射嗜水气单胞菌后,HSP70 B2-like在肝胰腺、血细胞和闭壳肌的表达量均显著上升,6 h开始上调(P＜0.05),持续到24 h,到48 h回落.而鳃中的HSP70 B2-like基因的表达则是先降后升再回落.研究结果表明,池蝶蚌HSP70 B2-like是一个应激蛋白基因,可能在机体耐受高温胁迫和抗病原菌浸染时发挥重要作用.

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)信号转导及转录激活因子STAT基因的初步功能,通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得STAT的cDNA全长序列(GenBank ID:KY123702),命名为HsSTAT,HsSTAT全长为2752 bp, 5′-非编码区(5′UTR)为121bp, 3′-非编码区3′UTR为264 bp, 开放阅读框(ORF)为2367 bp, 编码788个氨基酸; 生物信息学分析发现该蛋白结构域主要由STAT_int、STAT_alpha、STAT_bind、SH2四个经典保守性功能域组成; 缬氨酸最多占12.9%.色氨酸使用频率为100%.二级结构中α螺旋最多占46.83%、β折叠最少占8.5%.HsSTAT蛋白亲水性指数为- 0.531, 是亲水性蛋白.预测到棕榈酰化修饰位点1个, 小泛素相关修饰序列3个, 磷酸化修饰位点22个.系统进化树分析显示, HsSTAT与光滑双脐螺STAT5B和盘鲍STAT5聚在一支;亚细胞定位结果显示HsSTAT定位于血细胞的细胞质中;荧光原位杂交结果显示HsSTAT主要在细胞核.qPCR结果显示HsSTAT在所有的组织中均有表达, 其在组织中的表达量在肝胰腺中最高, 在血细胞中最低.细胞增殖实验显实验组增殖率为119%,高于对照组.实验已克隆到HsSTAT的全长序列,HsSTAT可能为STAT5亚型, 具有促进SMCC-7721细胞增殖的功能, 推测具有池蝶蚌细胞的信号转导功能参与池蝶蚌的先天免疫.

C-型凝集素(C-type lectin,CTL)是存在动、植物及微生物中一类Ca2+依赖性的糖蛋白,能够识别和结合病原微生物表面的多糖物质,在机体免疫防御中起重要作用.为了解淡水育珠贝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)CTL的分子特征及潜在作用,结合转录组高通量测序和末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)从池蝶蚌中鉴定了一条与其他物种CTL同源的cDNA序列,命名为HsCTL.该序列全长为1716 bp,包括5′ 端非编码区92 bp,3′端非编码区898 bp,开放阅读框长726 bp,编码241个氨基酸,预测蛋白质相对分子量为28 ku.其氨基酸序列存在一个由23个氨基酸残基组成的信号肽和一个糖配体识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),CRD结构域中仅包含1个QPD(Gln-Pro-Asp)基序.序列同源性及进化分析表明,HsCTL与斑节对虾(Penaeus monodon)CTL同源性最高,达36％,而与目前GenBank公开的其他贝类CTLs的同源性为9.7％ ～18.1％.构建的系统进化树显示,HsCTL与斑节对虾和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensiss)的同系物聚为一支,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)perlucin和九孔鲍(Haliotis diversicolor)CTL聚为相邻支.通过实时荧光定量RT-PCR检测发现,HsCTL的mRNA广泛分布于池蝶蚌各个组织,其中在血细胞表达量最高,外套膜和肝胰腺次之.且进一步发现,注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)后,HsCTL的mRNA表达量在血细胞和肝胰腺组织中显著增加.以上结果表明,HsCTL在池蝶蚌抵抗病原微生物的免疫防御反应中可能起到重要作用,结果为进一步研究HsCTL参与池蝶蚌先天免疫的分子机制打下基础.

池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)和三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)的亲缘关系一直存在争议,为了更深入地对淡水珠蚌进行系统发育分析,研究对池蝶蚌及其3个近缘物种三角帆蚌、褶纹冠蚌(Cristaria plicata)和背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的转录组进行了比较分析.对它们共有单拷贝同源基因进行多序列联配后计算这4种淡水珠蚌之间的遗传距离,结果表明池蝶蚌和三角帆蚌的遗传距离只有0.00746(小于1％),而其他淡水珠蚌之间的遗传距离几乎是它的10倍(平均大于6％).系统发育分析表明,小方蚌亚科与无齿蚌亚科大约在5144万年前发生分歧,而池蝶蚌和三角帆蚌发生分化的时间大约在424万年前.进一步的遗传差异分析鉴定了池蝶蚌转录组中的特有基因,其中KEGG通路富集的结果表明这些基因主要富集在免疫细胞膜分子和蛋白消化吸收等通路上.同时,GO注释结果表明有很多特有基因与池蝶蚌的优良性状相关,如与发育相关的生长发育、系统发育和动物器官发育等生物学过程,及与免疫相关的免疫系统过程、抗原处理和呈递等生物学过程.以上结果表明,池蝶蚌和三角帆蚌具有更近的亲缘关系,它们可能是同一物种的不同亚种或不同种群,这对淡水珠蚌种质资源的保护和遗传育种具有重要参考意义.此外,相比于三角帆蚌,池蝶蚌可能具有一些与生长发育及免疫相关的特有基因,这为探究相关的分子机制提供了线索.

为探究温度对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺发育的影响,研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察,并采用5个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化.通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRT-PCR检测,同时利用原位杂交技术对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位.结果显示:在自然条件下,6月龄池蝶蚌出现了雌雄同体现象,28月龄的雌雄同体蚌到30月龄左右会出现不同性别的分化(77.8％分化为雄蚌,16.7％维持雌雄同体现象,5.5％分化为雌蚌).在不同温度刺激下,14月龄池蝶蚌出现了雌雄同体和性逆转现象.32℃刺激,14月龄雄蚌出现12.5％雌雄同体;27℃刺激,14月龄雄蚌和27月龄雄蚌分别出现37.5％和12.5％性逆转;23℃刺激,14月龄雌蚌出现14.29％性逆转;19℃刺激,14月龄雌蚌出现25％性逆转.qRT-PCR结果显示:Dmrt1在胚胎及6、27月龄表达显著高于其他时期,32℃刺激,在27月龄雄蚌中的表达显著高于其他温度,19℃刺激,在14、27月龄雌蚌中的表达显著高于其他温度;Fem1b、Fem1c的时空表达趋势基本一致,与Tra2a大体一致,在5、32月龄与Sox9相互抑制;19℃、23℃和27℃刺激,Fem1b、Tra2a和Sox9三个基因在14月龄雄蚌中表达显著高于其他温度,且23℃刺激,Sox9在27月龄雄蚌中表达也显著高于其他温度;Foxl2在27℃下的27月龄雌蚌中表达显著高于其他温度.Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五个基因在不同月龄的雌雄同体蚌内表达有显著差异,Foxl2在雌蚌和雌雄同体蚌内表达显著高于同期雄蚌.原位杂交技术结果显示,Dmrt1 mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、初级精母细胞和成熟卵母细胞中.综上所述,温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化,27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象,23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转;并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量,从而调节生殖滤泡分化的.

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp,5'端非翻译区(5'UTR)为485 bp,3'端非翻译区(3'UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低;HsPif蛋白亲水指数为-0.566,为亲水蛋白.构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上.组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生.进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明,HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考.

为研究淡水贝类NF-κB/Rel信号通路中核因子κB(Nuclear factor-κappaB,NF-κB)和NF-κB抑制因子(Inhibitors of NF-κB,IκB)的功能,对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)IκBα和c-Rel(以下简称HsIκBα和Hsc-Rel)的序列结构、表达特征及HsIκBα和Hsc-Rel之间的相互关系进行了分析.结果表明,HsIκBα的cDNA全长为1783 bp,其开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为1083 bp,编码360个氨基酸.Hsc-Rel的cDNA为2414 bp,ORF为2298 bp,编码765个氨基酸.通过构建HsIκBα-ORF-GST和Hsc-Rel-RHD-HIS重组质粒、原核诱导表达和纯化,进行GST-pull down,通过SDS-PAGE和Western Blot检测研究,发现HsIκBα和Hsc-Rel-RHD存在直接的相互作用.通过对池蝶蚌进行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后,分别在7个时间点(0、6h、12h、24h、36h、48h和72h)对10个组织中HsIκBα和Hsc-Rel的mRNA表达差异性进行分析,结果显示:HsIκBα和Hsc-Rel的mRNA在所有组织都有表达,且在肝胰腺组织表达最高,在血细胞表达最低.在6h时,HsIκBα在8个组织中和Hsc-Rel在7个组织中的表达水平都出现下调;在12h时,HsIκBα在10个组织中的表达量都上调,并且都达到了峰值.Hsc-Rel只有血细胞、心脏、肝胰腺和肠出现上调;在24h时,HsIκBα在10个组织中的表达值呈现下调,Hsc-Rel却都出现上调(肾组织除外),其中血细胞、斧足、肠的表达值达到峰值;在36—72h,HsIκBα和Hsc-Rel的部分组织的表达值逐渐恢复到基础水平,以上结果表明,HsIκBα和Hsc-Rel的表达量随着LPS的诱导而产生明显变化,说明其参与免疫应答反应,且可能存在应答LPS的NF-κB通路.