为研究亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742).三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237bp,其5'非编码区(UTR)长度为57 bp,3'非编码区长度为688bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸,CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD.在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39％)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44％)、菲律宾蛤仔(Rudita-pes philippinarum)(78.05％)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66％)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05％).通过SWISS-MODEL预测三角帆蚌CypA含有8个p折叠和2个a螺旋,可能形成CypA的活性中心区域.利用MEGA 5.1软件将三角帆蚌CypA与其他物种CypA基因进行序列比对并构建系统进化树,分析发现三角帆蚌CypA与池蝶蚌的CypA聚为一支,其与池蝶蚌CypA具有最近的亲源关系.通过qRT-PCR检测CypA基因在三角帆蚌不同组织中表达,发现三角帆蚌性腺中CypA基因的表达量最高,肝脏、肾和鳃中的表达量次之.对三角帆蚌浸泡感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),CypA基因在肝脏、性腺、肠和鳃中的表达水平在感染72h先升高后降低,其表达量在性腺和鳃中6h最高,肝脏中12h达到峰值,肠中24h达到最高值,表明三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后,可显著诱导CypA基因的表达.CypA基因在性腺中的表达量到达峰值的时间要早于肠与肝脏,且到达峰值时的相对表达量(14.91)也显著高于肝脏(9.89)、肠(9.78)和鳃(7.53),推测CypA在三角帆蚌性腺中具有防御细菌感染的重要作用,三角帆蚌性腺可能不仅具有生殖的功能,同时在免疫防御系统中也发挥着重要的作用.

近年来珠蚌养殖业一直饱受病害困扰,现有资料表明富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)蛋白在无脊椎动物的蛋白互作、识别过程和免疫反应中都起到至关重要的作用,本实验通过RACE法克隆并表达了三角帆蚌LRR基因,全长为3 492 bp,其中开放阅读框2 142 bp,编码713个氨基酸,其中5个氨基酸组成信号肽,而其余688个氨基酸则形成成熟肽,氨基酸序列经相关软件预测存在跨膜结构.运用荧光定量PCR技术分析LRR在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染后相关组织表达量的变化,分析发现,在非胁迫状态下,LRR基因在斧足中高表达,在其他组织中几乎不表达.嗜水气单胞菌刺激侵染后可以看到斧足和肝胰腺中LRR基因表达显著下调,而其他组织表达量在不同时间点均出现表达峰值,显示能被显著诱导,说明LRR基因表达可能与抵挡病原体入侵有关.

为探究三角帆蚌基质蛋白基因HcCA3的功能,本研究根据HcCA3基因的cDNA全长序列,设计并合成特定的干扰链(siRNA),将干扰链注射到三角帆蚌闭壳肌内,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测HcCA3基因在外套膜不同部位即前端缘膜(amp)、后端缘膜(pmp)和中央膜(mc)的表达变化.在RNA干扰预实验中,筛选了三条目的基因干扰链,其中siRNA-HcCA3-1干扰链干扰效果最好;同时筛选了4条阴性对照链,发现HcCA3基因在注射不同的阴性对照链的各个组织中的表达均呈现不同程度的显著性下降,并没有筛选到合适的阴性对照链.在RNA干扰正式实验中,随着累计注射干扰链siRNA-HcCA3-1,HcCA3基因在前端缘膜和后端缘膜内出现了相似的表达特征,12d出现了敲降作用(分别为对照组的28％和30％),HcCA3基因在中央膜中表达从12d开始显著下降(为对照组的84％),18d为对照组的76％.本实验通过累积注射siRNA-HcCA3-1,成功的抑制了HcCA3基因在外套膜不同部位的表达,推测该基因参与了贝壳和珍珠的矿化,为进一步研究HcCA3基因的功能提供了基础.

为了掌握三角帆蚌幼蚌贝壳形态及体重的生长规律,采用模型拟合的方法研究了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)幼蚌一个生长周期内4个贝壳性状形态及体重性状的生长规律.结果显示,三角帆蚌幼蚌的贝壳形态与体重的增长过程均遵循Logistic生长模型.运用Levenberg-Marquardt迭代法估计出生长模型中的3个生长参数,得到在观测周期内各性状的生长极限值分别为,壳长9.216 cm、壳高4.985 cm、壳宽2.212 cm、全高8.262 cm、体重75.240 g;各性状的快速生长区间分别为壳长2.211～5.181月龄、壳高2.107 ～ 5.363月龄、壳宽2.712 ～ 5.470月龄、全高2.294 ～ 5.026月龄、体重4.247～8.065月龄,可见体重具有明显的生长延缓现象.各性状的瞬时增长率曲线均呈钟型,先增大到达生长拐点后又逐渐减小;瞬时增长加速度曲线为倒S型曲线,有最高和最低点;相对增长率在养殖初期最大,然后随着生长逐渐下降.上述结果可为三角帆蚌的养殖生态及选择育种提供参考.

双壳贝类中有两种线粒体遗传方式,一种通过精子传递线粒体基因组,一种通过卵子传递线粒体基因组.这种现象被称为线粒体基因组的双单亲遗传(doubly uniparental inheritance,DUI).本实验首先对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)F、M-typeA TP8基因进行了克隆,得到了它们的cDNA全序列.F-typeA TP8基因全长275 bp,编码49个氨基酸;M-typeA TP8基因全长222 bp,编码58个氨基酸.在此基础上研究了三角帆蚌从胚胎时期到三龄成熟时期时F、M-typeA TP8基因的表达差异.胚胎期到8月龄的三角帆蚌性腺部位组织团中,M、F-typeA TP8基因在各时期均有表达,同时期对比发现,F-typeA TP8基因的表达量明显高于M-typeA TP8基因.12月龄雌雄三角帆蚌各组织中,F-typeA TP8表达量高于M-typeA TP8,处于主导地位.24月龄雌雄三角帆蚌各组织中,M、F-type A TP8均能检测到表达,M-typeA TP8仅在性腺中高表达.36月龄雌雄三角帆蚌各组织中,F-type A TP8均能检测到,M-type A TP8表达量都非常低;而在雄性中,仅在性腺中高表达.研究表明,随着三角帆蚌的发育,M-typeA TP8仅在雄性性腺中存在,在其他组织中选择性降解.

C-型凝集素(C-type lectin,CTL)是存在动、植物及微生物中一类Ca2+依赖性的糖蛋白,能够识别和结合病原微生物表面的多糖物质,在机体免疫防御中起重要作用.为了解淡水育珠贝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)CTL的分子特征及潜在作用,结合转录组高通量测序和末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)从池蝶蚌中鉴定了一条与其他物种CTL同源的cDNA序列,命名为HsCTL.该序列全长为1716 bp,包括5′ 端非编码区92 bp,3′端非编码区898 bp,开放阅读框长726 bp,编码241个氨基酸,预测蛋白质相对分子量为28 ku.其氨基酸序列存在一个由23个氨基酸残基组成的信号肽和一个糖配体识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD),CRD结构域中仅包含1个QPD(Gln-Pro-Asp)基序.序列同源性及进化分析表明,HsCTL与斑节对虾(Penaeus monodon)CTL同源性最高,达36％,而与目前GenBank公开的其他贝类CTLs的同源性为9.7％ ～18.1％.构建的系统进化树显示,HsCTL与斑节对虾和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensiss)的同系物聚为一支,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)perlucin和九孔鲍(Haliotis diversicolor)CTL聚为相邻支.通过实时荧光定量RT-PCR检测发现,HsCTL的mRNA广泛分布于池蝶蚌各个组织,其中在血细胞表达量最高,外套膜和肝胰腺次之.且进一步发现,注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)后,HsCTL的mRNA表达量在血细胞和肝胰腺组织中显著增加.以上结果表明,HsCTL在池蝶蚌抵抗病原微生物的免疫防御反应中可能起到重要作用,结果为进一步研究HsCTL参与池蝶蚌先天免疫的分子机制打下基础.

三角帆蚌碳酸酐酶Ⅳ(carbonic anhydraseⅣ,HcCA4)基因属于α-CA家族,这是一类含Zn2+的金属酶.α-CA家族加速了C02和HCO3-之间的相互转化,并对软体动物碳酸钙(CaCO3)的形成、酸碱平衡、钙化和生物矿化起重要作用.本研究通过RACE的方法得到了HcCA4的全长cDNA,共3 043 bp,其中3'与5'端的UTR分别为137 bp、2 021 bp和885 bp的ORF (Open reading frame)区,共编码294个氨基酸,分子量为34.086kD.对HcCA4的氨基酸序列进行同源性分析之后,发现一个完整的α-CA Superfamily结构域,证明HcCA4属于α-CA家族的基因.qRT-PCR结果表明:CA4基因在前端缘膜、中央膜、后端缘膜、斧足、肝、鳃、性腺和肾脏都有表达,在外套膜的前缘膜和中央膜,鳃中具有高表达.鳃是三角帆蚌呼吸器官,推测CA4参与呼吸作用;外套膜是三角帆蚌分泌矿化物质的关键组织,推测HcCA4参与珍珠层形成.

目的 分析三角帆蚌和马氏珍珠贝软体中的脂肪酸成分.方法 采用超声和索氏提取2种方法 对2种软体中的油脂进行提取,将提取出来的油脂进行甲酯化,过膜后GC-MS分析.结果 GC-MS结果 显示三角帆蚌中有25种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的19.45％,饱和脂肪酸48.25％;马氏珍珠贝共有26种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的55.81％,饱和脂肪酸21.92％.结论 超声提取脂肪酸与传统索氏含有量差异不大,但后者操作繁琐,提取时间久;马氏珍珠贝中脂肪酸含有量高于三角帆蚌,且不饱和脂肪酸含有量也更高.

目的 对马氏珍珠贝软体中核苷类成分进行分析并且考察干燥温度对核苷类成分的影响.方法 采用HPLC-Q-TOF/MS鉴别珍珠贝中核苷类成分,通过鉴别共有13种核苷类成分;使用HPLC-UV对不同温度干燥的珍珠贝软体进行核苷类成分含量测定.结果 显示60cC下干燥的马氏珍珠贝核苷含量最高,三角帆蚌在50℃含量最高.结论 马氏珍珠贝软体中除了大分子的蛋白质多糖外,实验首次对小分子的核苷类成分进行了鉴定并建立了HPLC-UV含量测定方法.

SOX基因家族是一系列在性别分化、胚胎发育、细胞多功能性的维持等方面具有重要作用的转录因子,在高等脊椎动物中研究比较深入,但在淡水珍珠蚌中却很少见.本研究利用RACE法克隆获得了三角帆蚌SOX2基因的序列,其cDNA全长为1 840 bp,开放阅读框为672 bp,编码氨基酸223个.该基因具有SOX基因家族典型的HMG-box蛋白结构域,与其他物种对比发现,保守性极高.实时荧光定量PCR组织表达结果显示,在斧足中表达量最高,在肝脏中最低,同时发现雌雄性腺之间存在极显著性差异,雌性性腺表达量明显高于雄性性腺;性腺在早期胚胎中表达量明显高于其他时期,推测SOX2基因参与了三角帆蚌的性别分化和胚胎发育过程.