HSP90 是广泛存在的分子伴侣,参与多种细胞行为,在生殖细胞的减数分裂过程中发挥重要作用,但尚不清楚在雌雄同体蚂蟥Whitmania pigra 性腺发育中的作用.为探究HSP90 对蚂蟥生殖细胞发育的影响,该研究对蚂蟥wpHSP90 基因进行了克隆,生物信息学分析以及表达量测定.结果表明,克隆得到的wpHSP90 全长 2 592 bp,其中开放阅读框(ORF)长为2 373 bp,编码 790 个氨基酸.预测wpHSP90 蛋白在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上有 85 个磷酸化修饰位点.结构域预测和多序列比较结果显示,wpHSP90 含有 HSP90 的 2 个保守结构域,与水蛭 Helobdella robusta 的同源性最高,序列相似度为80.72%.RT-qPCR结果表明,在 12～28℃,5 月龄蚂蟥性腺中wpHSP90 的相对表达量与温度呈正相关,其中雌性腺中的表达量明显高于雄性腺,且与精卵巢生殖细胞发育趋势一致.综上,wpHSP90 可能参与调控蚂蟥精卵巢生殖细胞的发育,尤其卵细胞的发育.该研究可为蚂蟥性腺发育机制的进一步研究提供参考.

采用组织切片和电镜技术,对蚂蟥生殖系统及生殖细胞的发生过程进行观察.结果表明:蚂蟥具有完全独立的雌雄生殖系统,11个月为1个生殖周期;精巢先于卵巢发育,当卵细胞仅为原始生殖细胞团时,精子已经初步具备了完整的形态,精细胞和卵细胞有序发育同步成熟;根据精细胞和卵细胞的发育情况,将精巢发育分为增殖期(1～3月龄)、生长期(4～5月龄)、休眠期(6～8月龄)、成熟期(9月龄)、排放期(10月龄)和退化期(11月龄)共6个时期,将卵巢的发育分为形成期(1～2月龄)、增殖期(3～4月龄)、生长期(5～8月龄)、成熟期(9月龄)、排放期(10月龄)、休止期(11月龄)共6个时期.结论:蚂蟥是“同步性雌雄同体”动物,精卵巢发育各有6个分期,精卵细胞有序发育同步成熟.

研究以线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)部分序列(614 bp)为分子标记,对捞刀河浏阳段河蚬Corbicula fluminea(n=40)的种群遗传多样性进行评价,并分别从性腺组织学和精子形态学两方面分析其生殖特征,以期丰富河蚬的繁殖生物学信息,为开展其人工繁殖及资源保护提供参考.结果显示,40条河蚬COⅠ基因序列共检出4种单倍型,17个变异位点,平均单倍型多样性、平均核苷酸多样性和平均核苷酸差异数分别为0.664±0.042、0.014±0.006和8.595.捞刀河浏阳段河蚬存在雌雄同体和雌雄异体2种性别系统,雌雄同体、雄性和雌性的性比约为6﹕3﹕1.雌雄同体个体生殖滤泡存在滤泡混合型和滤泡并存型2种类型.23个雌雄同体和8个雄性个体的精子均为双鞭毛.结果表明,捞刀河浏阳段河蚬种群的遗传多样性相对较低,生殖方式多样且以雄核生殖为主.

对分布在辽宁大连黑石礁、付家庄、石槽、金石滩、獐子岛与海洋岛沿岸的黏管藻[Gloiosiphonia capillaris(Hudson)Carmichael]的外部形态、营养与生殖结构、生物量、成熟个体比例与成熟个体生物量/总生物量(R/T指数)的变化、温度性质以及rbcL、COⅠ基因序列进行了详细研究.结果表明:(1)黏管藻配子体为雌雄同体,直立,单生或丛生,主轴明显,固着器呈圆盘状,质地胶质,颜色为红色或紫红色.采集于獐子岛与海洋岛的藻体长度和宽度明显高于其他采集地点;(2)藻体由皮层及髓部组成,皮层由6—10层细胞组成,髓部存在假根丝细胞.成熟囊果小,突出于藻体表面,呈球形或半球形,通常2—4个囊果聚集在一起;(3)黏管藻配子体的生物量在6月达到最大,平均生物量为3.628 g/m2.3—6月成熟个体比例逐渐增大,6月达到100％;(4)黏管藻配子体生长周期为3—7月,温度性质属于温带性;(5)rbcL基因序列分析表明,6个采集地点的样本间无碱基差异,与产自加拿大的黏管藻聚在一起,形成一个独立的分支.COⅠ基因序列分析表明,6个采集地点的样本间无碱基差异,形成一个独立的分支,均确定为黏管藻.

研究以沅江常德段蚬Corbicula为例,采用线粒体COⅠ分子标记对其进行谱系构建,梳理谱系与形态、倍性、性别和遗传多样性之间的关系,以期为蚬属的系统分类和生殖特征研究提供理论参考.结果显示,99条COⅠ序列(526 bp)中存在12个单倍型,共有17个变异位点,单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数分别为0.599、0.01236和6.503.12个单倍型在系统进化树中被聚为独立的两支(谱系RA和RlcB),但谱系间壳长、壳高和壳宽没有显著差异(P>0.05).99个样品中有二倍体50个、三倍体49个、雌雄同体71个、雌性21个、雄性7个.卡方检验发现,谱系与性别及倍性与性别之间均存在显著的相关性(P<0.05).谱系RlcB的单倍型数、变异位点数、单倍型多样性、核苷酸多样和平均核苷酸变异数均高于谱系RA.结果表明,虽然形态、倍性、性别和遗传多样性在谱系RA和RlcB蚬之间存在一定的差异,但均不足以作为区分两个谱系的生物学特征,而不同谱系是否为不同的种还有待于进一步的证实.

洞庭湖流域蚬属(Corbicula)贝类资源丰富,但其倍性尚未见报道.流式细胞术是一种基于DNA含量的动物倍性鉴定方法,目前尚未见其应用于蚬的倍性鉴定.本研究在传统核型分析的基础上,采用流式细胞术对沅江常德鼎城区江段的蚬进行倍性鉴定,梳理倍性与其形态、性别间的关系,以期为蚬的种质资源评价和管理提供理论依据.结果显示:45个样品中有二倍体30个,三倍体15个,核型公式分别为2n=36=2M+2SM+32ST和3n=54=3M+15SM+36ST.分别以二倍体太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)为参照,测得两种倍性蚬的DNA含量比值均为2:3.30个二倍体中雌雄同体、雄性和雌性的占比分别为53.4％、23.3％、23.3％;15个三倍体中雌雄同体、雄性和雌性的占比分别为46.7％、40.0％、13.3％.方差分析发现,两种倍性蚬的壳长、壳宽和壳高并无显著差异,但二倍体蚬的壳宽与壳长的比值显著大于三倍体蚬(P＜0.05).结果表明:流式细胞术简化了蚬的倍性鉴定,证实了核型分析结果,即二倍体和三倍体蚬共存于沅江常德鼎城区江段,且该江段两种倍性蚬均以雌雄同体为主,雌雄异体共存.开展大尺度环境因素对蚬倍性和性别特征的影响研究,有助于全面解析蚬属贝类倍性和生殖特征的演化机制.

蛋白激酶C(PKC)是一类广泛参与细胞增殖和发育的蛋白激酶,但在雌雄同体动物蚂蟥性腺中的发育机制尚不清楚.为探究蛋白激酶C在蚂蟥生殖细胞的发育过程中的作用,该研究克隆蚂蟥PKC基因,进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术进行雌雄性腺的表达分析.结果 表明:①克隆得到的Wp-PKC全长2 580 bp,相对分子质量76 555.19,包含1个编码670个氨基酸的开放阅读框,Wp-PKC和斑马鱼PKC-α及大鼠的PKC-γ亲缘关系较近,氨基酸序列相似度为55％和58％;②Wp-PKC编码的蛋白无信号肽,属于亲水性性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、折叠和组成,以无规则卷曲、α-螺旋占比最多,Wp-PKC蛋白不含有跨膜结构域,多序列比对和结构域预测分析显示,Wp-PKC包含4个经典蛋白激酶C的保守结构域;③荧光定量的结果显示Wp-PKC在蚂蟥性腺中的表达与生殖细胞的发育呈正相关,其中雄性腺中的表达显著高于雌性腺.综上,Wp-PKC为经典PKC,Wp-PKC可能对蚂蟥性腺发育尤其雄性腺发育起了促进作用,为蚂蟥性腺发育机制的进一步研究提供参考.

为探究温度对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺发育的影响,研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察,并采用5个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化.通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRT-PCR检测,同时利用原位杂交技术对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位.结果显示:在自然条件下,6月龄池蝶蚌出现了雌雄同体现象,28月龄的雌雄同体蚌到30月龄左右会出现不同性别的分化(77.8％分化为雄蚌,16.7％维持雌雄同体现象,5.5％分化为雌蚌).在不同温度刺激下,14月龄池蝶蚌出现了雌雄同体和性逆转现象.32℃刺激,14月龄雄蚌出现12.5％雌雄同体;27℃刺激,14月龄雄蚌和27月龄雄蚌分别出现37.5％和12.5％性逆转;23℃刺激,14月龄雌蚌出现14.29％性逆转;19℃刺激,14月龄雌蚌出现25％性逆转.qRT-PCR结果显示:Dmrt1在胚胎及6、27月龄表达显著高于其他时期,32℃刺激,在27月龄雄蚌中的表达显著高于其他温度,19℃刺激,在14、27月龄雌蚌中的表达显著高于其他温度;Fem1b、Fem1c的时空表达趋势基本一致,与Tra2a大体一致,在5、32月龄与Sox9相互抑制;19℃、23℃和27℃刺激,Fem1b、Tra2a和Sox9三个基因在14月龄雄蚌中表达显著高于其他温度,且23℃刺激,Sox9在27月龄雄蚌中表达也显著高于其他温度;Foxl2在27℃下的27月龄雌蚌中表达显著高于其他温度.Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五个基因在不同月龄的雌雄同体蚌内表达有显著差异,Foxl2在雌蚌和雌雄同体蚌内表达显著高于同期雄蚌.原位杂交技术结果显示,Dmrt1 mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、初级精母细胞和成熟卵母细胞中.综上所述,温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化,27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象,23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转;并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量,从而调节生殖滤泡分化的.

石斑鱼性成熟时间长和雌雄同体的特性延长了其育种的周期,采用人工雌核生殖策略能够显著提高选育效率.研究筛选了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)精子人工诱导斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)雌核生殖的最佳条件,并通过形态学、流式细胞术和微卫星分子标记等方法进行鉴定.结果显示,灭活的异源精子可成功诱导斜带石斑鱼人工雌核生殖,精子灭活的最佳紫外照射强度为518 mJ/cm2;卵子受精后6min在4—6℃的条件下进行冷休克处理,可获得最优的40％的表观受精率(卵子正常分裂比率)和29.7％的孵化率,而未冷休克的对照组具有83.5％的表观受精率和80％的单倍体率.多重比较结果表明,在表观受精率方面人工诱导的时间差异(P=0.579)和水温差异(P=0.133)并不显著;而在孵化率上,处理时间组间差异极显著(P=0.002),而在水温组中差异不显著(P=0.396).胚胎发育结果显示,人工雌核生殖诱导会导致孵化率降低,单倍体胚胎出现明显的发育障碍.微卫星分子标记鉴定结果显示,石斑鱼人工雌核生殖子代的遗传物质大部分来自于母本,同时也存在异精效应.

目的 了解家猫感染东方次睾吸虫的形态学及基因特征,为当地开展东方次睾吸虫病防控工作提供理论依据.方法 采集浦城县感染有东方次睾吸虫囊蚴的麦穗鱼,剪碎囊蚴寄生处的鱼尾部肌肉,喂食2个月龄家猫.45d后连续多天检测家猫粪便中的虫卵,直至发现虫卵后进一步深入检查.观察肝脏及胆囊变化和虫体寄生部位,捡出虫体置于生理盐水中,对虫体的形态学特征进行观察与鉴定描述.提取虫体基因组DNA,PCR扩增ITS基因序列,测序后在GenBank上进行BLAST比对,采用邻接法构建系统进化树.结果 从胆囊和肝脏分离获得13条东方次睾吸虫.东方次睾吸虫为雌雄同体,虫体大小约为(1.95～2.86)mm×(0.61～0.93)mm;虫卵呈长椭圆形,似葵花籽状,虫卵大小约(28～32)μm×(16～18)μm.PCR结果显示,ITS基因序列扩增产物260 bp.BLAST比对结果显示,与国内已报道家鸭及黑天鹅感染的东方次睾吸虫(GenBank登入号分别为MT231323.1、MK482055.1、MK482052.1)的序列一致性均为99.62％.基于ITS基因的系统进化树显示,本研究分离获得的吸虫ITS序列属于次睾属,与东方次睾吸虫(GenBank登入号分别为HM347224、KX832894、MK482055、MT231323、KX857496、MK482052)属于同一个分支.结论 从家猫分离的虫体经形态学及基因分析与文献报道的一致,鉴定为东方次睾吸虫.