目的:探讨长非编码RNA HOXA簇反义RNA 3(LncRNA HOXA-AS3)通过miR-218-5p调控泛素特异性肽酶3(USP3)对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响。方法:体外培养人前列腺上皮细胞和人前列腺癌细胞系DU-145、PC-3、22RV1，将DU-145细胞分为对照组、LncRNA HOXA-AS3过表达组、LncRNA HOXA-AS3敲低组、共转染阴性对照组、LncRNA HOXA-AS3敲低＋miR-218-5p inhibitor组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和免疫印迹法检测LncRNA HOXA-AS3、miR-218-5p与USP3的表达；采用免疫荧光染色检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达比值(Bax/Bcl-2)；采用免疫印迹法检测增殖(PCNA、Cyclin D1)与凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)的表达；采用双荧光素酶报告基因实验检测前列腺癌细胞中LncRNA HOXA-AS3对miR-218-5p的靶向调节。结果:与人前列腺上皮细胞相比，DU-145、PC-3、22RV1细胞的LncRNA HOXA-AS3、USP3的mRNA与蛋白表达升高，miR-218-5p表达降低(均 P<0.05)。与对照组比较，LncRNA HOXA-AS3过表达组LncRNA HOXA-AS3、USP3的mRNA与蛋白表达、细胞活力、集落生成率、PCNA与Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达升高，miR-218-5p表达、凋亡细胞比例、细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、Bax蛋白表达降低(均 P<0.05)；LncRNA HOXA-AS3敲低组的细胞LncRNA HOXA-AS3、USP3的mRNA与蛋白表达、细胞活力、集落生成率、PCNA与Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达降低，miR-218-5p表达、凋亡细胞比例、凋亡率、Bax/Bcl-2、Bax蛋白表达升高(均 P<0.05)。与LncRNA HOXA-AS3敲低组比较，LncRNA HOXA-AS3敲低＋miR-218-5p inhibitor组的USP3的mRNA与蛋白表达、细胞活力、集落生成率、PCNA与Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达升高，miR-218-5p表达、凋亡细胞比例、细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、Bax蛋白表达降低(均 P<0.05)。共转染miR-218-5p mimics和野生型LncRNA HOXA-AS3报告质粒的相对荧光素酶活性降低(0.34±0.06 vs.1.01±0.22， P<0.05)。 结论:敲低LncRNA HOXA-AS3可通过上调miR-218-5p而降低USP3表达，从而抑制前列腺癌细胞增殖，并促使其凋亡。

目的:探讨泛素特异性肽酶22（USP22）在结直肠癌多药耐药中的作用以及与多药耐药基因P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）的相关性。方法:筛选USP22低表达的结直肠癌细胞系RKO、SW480，转染USP22过表达质粒使USP22表达上调。用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测USP22对结直肠癌细胞奥沙利铂耐药的影响。用相同的奥沙利铂浓度处理细胞，Western 印迹检测细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、Bcl-2和耐药蛋白MRP1、P-gp的表达。细胞外排实验检测上调USP22对钙黄绿素AM（Calcein-AM）和罗丹明123（rhodamine123）的影响。免疫组化方法检测奥沙利铂化疗敏感组与耐药组中USP22、MRP1及P-gp的表达以及分析USP22与MRP1及P-gp的相关性。结果:CCK-8实验结果表明，SW480-USP22（SW480细胞过表达USP22）对奥沙利铂处理24 h和48 h的IC 50为（4.62±0.05）μmol/L和（2.32±0.04）μmol/L，与对照细胞相比分别高2.7倍和3.0倍。用1.25 μmol/L的奥沙利铂处理细胞48 h，USP22过表达可抑制SW480细胞凋亡；细胞外排实验中SW480-USP22组Calcein-AM和rhodamine123的荧光强度与对照细胞相比明显升高，差异有统计学意义（均 P<0.01）；SW480-USP22细胞中MRP1和P-gp的蛋白表达水平与对照细胞相比显著增加，差异有统计学意义（均 P<0.01）。免疫组化结果表明，奥沙利铂化疗敏感组USP22、MRP1、P-gp的阳性表达率和化疗耐药组相比显著降低，差异有统计学意义（ P<0.05），USP22与MRP1、P-gp在结直肠癌组织中的表达均呈正相关（ r1=0.377， r2=0.423， P<0.05）。 结论:USP22上调与结直肠癌细胞对奥沙利铂的获得性耐药有关，USP22可能通过调控P-gp、MRP1的表达参与结直肠癌铂类化疗耐药的过程。

目的:探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22，USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法:通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA，Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide，CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal，MG132)分别处理转染后的细胞，检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响，明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后，以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果:USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性，并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解，进而增强HBx的生物学功能。结论:USP22抑制HBx通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解，增强HBx蛋白稳定性并促进HBx功能。

目的 探讨泛素特异性肽酶22 (USP22)对人胃癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 设计、合成针对USP22特异性小干扰RNA (siRNA)片段,通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western blot筛选抑制效率最高的siRNA片段以备后续实验;抑制USP22后,噻唑蓝(MTT)法检测胃癌细胞SGC-7901细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及凋亡变化;抑制USP22后,Western blot检测周期、凋亡相关蛋白的表达变化.结果 成功设计、合成针对USP22 siRNA片段,其抑制效率高达80％;USP22抑制后,胃癌细胞SGC-7901增殖明显受到抑制,细胞停滞于Go/G1期[(52.87±1.41)％比(73.73±1.78)％,t=15.491,P=0.000].同时凋亡率显著增加[(19.63±0.82)％比(4.54±0.46)％,=58.051,P=0.000];Western blot结果显示bel-2相关X蛋白(bax)表达水平显著上升(t =9.580,P=0.001)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)及pro-半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)的表达量显著降低(t=6.674、7.269;P=0.000、0.000);磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及下游磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)表达水平显著降低(t=13.512、6.846;P=0.003).结论 抑制USP22后,可能通过影响Akt活化,抑制胃癌细胞增殖及诱导细胞凋亡.

目的 探讨泛素特异性肽酶22( USP22)对肝癌细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 采用RT-PCR和Western blotting分别检测人正常肝Chang liver细胞和人肝癌HepG2细胞中USP22 mRNA及蛋白表达.利用脂质体转染USP22-siRNA靶向沉默USP22基因,并采用RT-PCR和Western blotting检测其沉默效果;流式细胞仪检测USP22基因沉默对HepG2细胞周期和细胞凋亡的影响,Western blotting检测USP22基因沉默对HepG2细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3( Cleaved caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved caspase-9)、细胞周期素 D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)表达的影响.结果 USP22基因在人肝癌HepG2细胞中表达明显高于人正常肝Chang liver细胞(P<0. 05);siRNA干扰HepG2细胞后,与对照组相比,干预组中USP22 mRNA和蛋白的表达均显著降低(P<0. 05),而阴性组差异无统计学意义(P>0. 05).靶向沉默USP22基因后,与对照组相比,干扰组中G0/G1期细胞所占比例显著升高,S期和G2/M期细胞所占比例显著下降,细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P<0. 05);阴性组与对照组间G0/G1期、S期、G2/M期细胞所占比例和细胞凋亡率相比,差异无统计学意义(P>0. 05).与对照组相比,干预组中Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CyclinD1和CDK2蛋白的相对表达量均显著降低(P<0. 05),阴性组与对照组间差异无统计学意义(P>0. 05).结论 USP22基因沉默可诱导肝癌HepG2细胞凋亡,其作用机制可能与周期蛋白Cyclin D1、CDK2及凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表达下降有关.

为克隆鉴定甘蔗泛素结合酶基因 (Sugarcane ubiquitin-conjugating enzyme, ScUBc E2) 并探索其在激素信号通路和甘蔗与黑穗病互作过程中的作用, 选择黑穗病菌胁迫下甘蔗抑制消减杂交文库 (Suppression subtractive hybridization, SSH) 中注释为泛素结合酶的差异表达EST序列为探针, 结合电子克隆技术和RT-PCR技术, 以甘蔗cDNA为模板进行泛素结合酶基因克隆.对克隆获得的序列进行生物信息学分析, 并利用qRT-PCR技术分析该基因在甘蔗根、蔗髓、叶、芽中的组织特异性表达以及在黑穗病菌、茉莉酸甲酯 (Methyl jasmonate, Me JA) 、脱落酸 (Abscisic acid, ABA) 和水杨酸 (Salicylic acid, SA) 胁迫下的表达情况.最终克隆得到一条长度为699 bp的甘蔗泛素结合酶基因 (ScUBc E2;Gen Bank accession number:KJ577594.1), 该基因包含长度为447 bp的完整开放读码框, 编码148个氨基酸.生物信息学分析结果显示, ScUBc E2编码的蛋白分子量 (Mr) 为16.507×103;无信号肽, 为碱性不稳定的亲水蛋白;包含4个α螺旋、4个β折叠和一些无规则卷曲;第15位氨基酸为泛素化位点, 74-89位氨基酸为活性位点;在进化过程中与高粱泛素结合酶基因的亲缘关系最近.qRT-PCR分析结果表明, ScUBc E2基因组成型表达, 但在芽中的表达量最高;其表达在甘蔗感黑穗病基因型ROC22中受到黑穗病菌胁迫的抑制, 在黑穗病抗病基因型YC05-179中则先被抑制, 后被诱导;ScUBc E2基因受MeJA及SA诱导表达, 对ABA胁迫的响应不明显.本研究表明, 甘蔗ScUBc E2基因在抗病基因型和感病基因型甘蔗中存在不同表达模式, 可能参与甘蔗与黑穗病菌的互作过程, 有望为抗病育种分子标记提供潜在基因资源;同时, 该基因受MeJA和SA外源激素胁迫后的表达模式, 可为泛素-蛋白酶体途径及激素调控的信号转导在甘蔗与黑穗病菌互作过程中的作用提供一定的理论依据.

目的 探讨miR-939-5p对泛素特异肽酶22(USP22)基因表达的调控作用及对肝癌迁移和增殖的影响.方法 采用荧光定量PCR (qPCR)检测肝癌细胞株(HepG2、MHCC-97H、SMMC-7721、BEL-7404和Huh7)和正常肝细胞株LO2中miR-939-5p的表达.以表达量最低的肝癌细胞为实验对象,转染miR-939-5p(实验组)或miR-NC(对照组).qPCR检测miR-939-5p的转染效率.Transwell迁移实验和四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)增殖实验检测miR-939-5p对肝癌细胞迁移和增殖能力的变化.生物信息学软件预测miR-939-5p的靶基因.双荧光素酶报告基因验证miR-939-5p与靶基因的相互作用.qPCR和Western blotting检测高表达miR-939-5p后靶基因在mRNA和蛋白水平的表达.计量数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用t检验.结果 肝癌细胞株中miR-939-5p的表达均明显低于正常肝细胞(P＜0.01),SMMC-7721细胞中miR-939-5p的表达最低(P＜0.01).miR-939-5p可有效转染进入SMMC-7721细胞内[(1.01±0.07)比(20.12±1.27),P＜0.01].高表达miR-939-5p可抑制肝癌SMMC-7721细胞的迁移能力(P＜0.01)和增殖能力(P＜0.05).USP22基因可能为miR-939-5p的靶基因.荧光素酶报告基因证实miR-939-5p能与USP22 mRNA的3'-UTR特异性结合(P＜0.01).高表达miR-939-5p后USP22在mRNA和蛋白水平上表达降低(P＜0.01).结论 miR-939-5p在肝癌细胞株中表达降低,可抑制肝癌SMMC-7721细胞的迁移和增殖能力,其分子机制为靶向干扰USP22基因的表达.

目的 探讨泛素特异性肽酶22(USP22)作用于Wnt/β-catenin信号通路参与结直肠癌的发生和化疗耐药的分子机制.方法 采用氟尿嘧啶(5-Fu)处理结直肠癌细胞株HT-29,建立耐药细胞株HT-29/5-Fu;构建USP22 siRNA稳定表达细胞株(表示为HT-29-sh USP22、HT-29/5-Fu-sh USP22).CCK-8法检测HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性、抑制USP22表达后结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的影响;采用Western blotting检测不同质量浓度5-Fu诱导下HT-29细胞中USP22蛋白表达,HT-29和HT-29/5-Fu细胞中USP22和 β-catenin蛋白表达,以及抑制USP22表达对结直肠癌细胞USP22、β-catenin表达的影响.结果 (1)HT-29与HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的IC50值分别为(1.58±0.23)mg/L和(14.58±0.94)mg/L,其中HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性显著下降(n=6,t=8.476,P<0.01).(2)在0.5、5.0 mg/L的5-Fu诱导后,HT-29细胞内USP22蛋白表达水平(USP22/β-actin)显著升高(0.5 mg/L vs 0 mg/L:t=7.618,P<0.05;5.0 mg/L vs 0 mg/L:t=6.992,P<0.05).HT-29/5-Fu组中USP22蛋白表达水平为0.92±0.11,显著高于HT-29组的0.18±0.06(t=7.618,P<0.05).(3)HT-29-sh USP22组对5-Fu的IC50为(0.25±0.23)mg/L,显著低于HT-29组(t=6.662,P<0.01).HT-29/5-Fu-sh USP22组对5-Fu的IC50为(1.36±0.14)mg/L,显著低于HT-29/5-Fu组(t=7.002,P<0.01),但与HT-29组相比,差异无统计学意义(t=1.586,P>0.05),抑制USP22表达可增强结直肠癌细胞HT-29对5-Fu的敏感性.(4)HT-29-sh USP22组的USP22蛋白表达水平为0.07±0.01,与HT-29组相比下调(t=7.105,P<0.01).HT-29/5-Fu-sh USP22组的USP22蛋白表达水平为0.33±0.02,与HT-29/5-Fu组相比,USP22蛋白表达水平下调(t=6.153,P<0.01).HT-29-sh USP22、HT-29/5-Fu-sh USP22中 β-catenin蛋白表达水平与相应对照组HT-29、HT-29/5-Fu相比显著下调(HT-29-sh USP22 vs HT-29:t=8.823,P<0.01;HT-29/5-Fu-sh USP22 vs HT-29/5-Fu:t=7.656,P<0.01).结论 5-Fu可诱导结直肠癌细胞USP22表达增高.抑制USP22表达可增加结直肠癌细胞对5-Fu的药物敏感性,其机制可能是抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而有效逆转结直肠癌细胞对5-Fu的耐药.

目的 探讨泛素特异性肽酶22(USP22)在鼻咽癌组织中的表达及其与临床病理因素和预后的关系.方法 采用免疫组织化学法检测USP22蛋白在60例鼻咽癌组织和20例鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达,并分析其在鼻咽癌组织中的表达与临床病理因素和预后的相关性.结果 USP22在鼻咽癌中的阳性表达率明显高于鼻咽黏膜慢性炎组织,差异有统计学意义(P＜0.05);USP22的阳性表达率与淋巴结转移有显著的关系(P＜0.05),而与患者性别、年龄、病理组织分型等临床病理特征无明显相关性(P＞0.05);USP22阳性表达患者的3年生存期和3年无进展生存期较USP22阴性表达患者短.结论 USP22在鼻咽癌组织中的表达上调,且与淋巴结转移有相关性.USP22阳性表达的鼻咽癌患者预后较阴性表达者差.检测USP22蛋白的表达有助于鼻咽癌的病理诊断与鉴别诊断和预后判断,USP22有望成为鼻咽癌的治疗靶点.

目的 利用RNA干扰技术探讨泛素特异性肽酶22(USP22)对人结直肠癌细胞增殖的影响.方法 免疫荧光检测结直肠癌组织中USP22的表达;Western blotting检测体外培养的HCT-116、SW480、HC-29结直肠癌细胞株中USP22的表达,筛选出表达量最高的细胞作为研究细胞.设计、合成针对USP22特异性siRNA,同时设置阴性对照siRNA,利用脂质体转染结直肠癌细胞后,Western blotting检测siRNA抑制效率;通过MTT法检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞的周期及凋亡;Western blotting检测周期相关蛋白CyclinB1、p21、p53、CDK2的表达.结果 结直肠癌组织中USP22表达量与癌旁组织比较,差异有统计学意义(P<0.05),结直肠癌组织中USP22表达量升高.SW480细胞中USP22的表达量最高,因此作为靶细胞进行后续研究.与对照组比较,USP22 siRNA能够降低USP22的表达(P<0.05).USP22抑制后,与对照组比较,能够抑制SW480细胞的增殖,促使SW480细胞停滞于G0/G1期,抑制细胞周期进程,增加细胞凋亡率(P<0.05),进而抑制细胞增殖(P<0.05);同时,与对照组比较,CyclinB1、CDK2的表达量降低(P<0.05),p53和p21的表达量升高(P<0.05).结论 USP22抑制后,能够抑制结直肠癌细胞的增殖,其机制可能与抑制细胞周期进程、促进细胞凋亡有关.