为获得能够把难溶性磷转化为可溶性磷的解磷微生物,从茅台酒厂种植地的土壤中分离筛选出两株具有解磷能力的菌株,并对这两株菌株进行分子生物学鉴定及解磷性能分析,测定其发酵液中的有机酸,初步探究解磷机理和在酒糟中的生长能力.结果表明,筛选的P1 和P2 菌株分别为路氏肠杆菌(Enterobacter ludwi-gii)和分散泛菌(Pantoea dispersa).P1 和 P2 单菌培养的难溶磷降解率分别在第 10 天和第 1 天达到最高9.62%和7.56%,P1 和P2 混菌(P3)培养难溶磷的降解率在第2 天达到最大为18.83%.不同条件下菌株对难溶磷的降解率有一定影响,其中 40℃混菌培养在第 6 天高达 33.82%.P1 主要产乙酸,高达 4 103.65 mg/L,P2 主要产乙酸和琥珀酸,混菌培养主要产乙酸,其次是草酸.两株菌在酒糟中具有较强的生长能力,为解磷功能菌株制备酒糟生物有机肥提供一定的参考.

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响.研究结果表明该菌耐盐性较好,在含 7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为 3.32 mg·mL-1.该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定.筛选获得 1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为 76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育.该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础.

外生菌根真菌(ectomycorrhizal fungi,ECMF)可广泛与林木建立共生关系,促进林木对土壤磷的吸收.然而,不同菌种或菌株溶解不同磷源的能力不同,且影响菌株或菌种溶磷能力的生理因素尚不清楚.因此,本研究以从板栗Castanea mollissima和锥栗C.henryi林下采集的真菌子实体进行分离纯化及 ITS 序列的同源性分子鉴定所获得的 5 个菌株,和前期课题组获得的土生空团菌Cenococcum geophilum(CG)为研究对象,将其在以难溶性有机磷(植酸钙 C6H6Ca6O24P6、卵磷脂C42H80NO8P)和难溶性无机磷(磷酸铝AlPO4、磷酸铁FePO4)为磷源的蒙塔纳(Montana)培养基中进行培养,测定6个ECMF菌株在纯培养条件下的菌落直径、菌丝干质量、溶磷率、酸性磷酸酶活性、pH 值、柠檬酸和草酸含量,分析在不同难溶性磷源下各菌株的生长及溶磷特性;并运用皮尔逊相关性分析,探讨不同难溶性磷源下影响菌株溶磷率的主要生理因素.结果表明:(1)6个ECMF菌株在不同难溶性磷下生长速率差异显著(P<0.05).橙黄硬皮马勃Scleroderma citrinum(LY-20-2)在磷酸铝条件生长最快,中华豆马勃Pisolithus orientalis(LY-8)在其他 3 种难溶性磷源下生长均最快.(2)6个ECMF菌株对4种难溶性磷的溶磷能力具有显著差异(P<0.05).以植酸钙为磷源时,LY-8溶磷率最高,达 28.9%;以卵磷脂和磷酸铁为磷源时,LY-20-2 的溶磷率最高,分别为 3.2%和 4.6%;以磷酸铝为磷源时,CG的溶磷率最高,达 3.2%.(3)在 4种难溶性磷源下,各菌株发酵液中的pH值均降低.以卵磷脂和磷酸铁为磷源时,除马勃Scleroderma sp.2(MB)以外,其他菌株均未分泌草酸.(4)以植酸钙为磷源时,菌落直径、菌丝干质量、酸性磷酸酶活性和草酸含量均与菌株溶磷率呈显著正相关(r=0.61-0.88);以卵磷脂为磷源时,菌落直径和酸性磷酸酶活性与菌株溶磷率呈显著正相关(r=0.50-0.95);以磷酸铝为磷源时,溶磷率与柠檬酸呈显著正相关(r=0.55);以磷酸铁为磷源时,溶磷率与柠檬酸含量没有显著相关性(r=0.44);在 4 种难溶性磷源下,溶磷率与pH值均呈极显著负相关关系(r=-0.88--0.70).以上结果表明,栗林下的ECMF菌株对难溶性有机磷植酸钙的利用潜力高于卵磷脂和难溶性无机磷磷酸铝、磷酸铁.ECMF针对不同难溶性磷源采取了不同的溶磷策略,包括调控生长速度和分泌不同种类的有机酸.

[目的]对实验室分离筛选得到的一株解淀粉芽孢杆菌SQ-2 进行促生特性研究,确定该菌株对水稻促生的浓度范围与作用机制,并分析接种菌株前后的土壤菌群结构.[方法]利用钼蓝比色法与固氮酶试剂盒对菌株SQ-2 的溶磷能力及固氮酶活性进行检测.将 102、104、106、108 和 3×108 CFU/mL的菌悬液接种至水培与土培水稻中,分别培养 14 d和 20 d后测定其水培、土培水稻的根茎干鲜重、茎长与茎粗.采用苯酚-次氯酸钠比色法、茚三酮检测法与 3,5-二硝基水杨酸比色法测定土培水稻土壤中脲酶、蛋白酶与蔗糖酶的活性.利用pH计电位法检测土壤pH值,用对应试剂盒检测土壤速效氮磷钾含量及酸性磷酸酶活性,并对接种 3×108 CFU/mL组的土培水稻土壤进行根际细菌群落结构分析.[结果]菌株SQ-2 对磷酸三钙的溶解量为 229.63 mg/L,固氮酶活性为 55.07 U/L.与对照相比,接种菌悬液浓度在 104 CFU/mL时,水培水稻根的干、鲜重增长最为显著;在接种浓度为3×108 CFU/mL时,土培水稻根茎的干、鲜重增长最为显著.随着接种菌悬液浓度的升高,上述土壤酶活性与速效氮磷钾浓度都有着不同程度的增加,而接种菌株 3×108 CFU/mL的土壤pH值则由原来的 7.83 降至 7.26.接种菌株SQ-2 改变了水稻根际土壤中的菌落构成,显著提高了土壤α多样性的Ace、Chao、Sobs与Shannon指数.[结论]解淀粉芽孢杆菌 SQ-2 对土培、水培水稻均有不同程度的促生效果.在土培实验中,能够通过提高土壤酶活性、速效氮磷钾水平及改变土壤菌群结构来起到促生作用,为细菌菌肥的研发提供了新的菌株资源.

[目的]黄淮海平原小麦玉米生产区主要实行冬小麦-夏玉米轮作种植模式.砂质潮土是广泛分布于黄淮海地区的土壤,属性和衍生障碍较多,包括结构性较差、蓄水保肥能力较弱等.为了提高肥料利用率、改善土壤肥力,综合实现作物产量提升和品质优化,筛选了一株多功能促生菌,并在该轮作体系验证其广谱促生效应.[方法]从玉米根际砂质潮土中筛选多功能促生菌,测定其产吲哚乙酸(IAA)、溶有机磷、解钾能力.通过形态学、生理生化及 16S rDNA序列分析方法对其种属进行鉴定.摇瓶条件下探究其产IAA的最适条件,通过玉米盆栽验证其促生能力,通过冬小麦-夏玉米大田试验验证其在轮作体系中的广谱性增产效果.[结果](1)试验筛选得到一株命名为YM3 的多功能根际促生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其产IAA能力达到59.21 mg/L、解有机磷能力达到 0.72 mg/L、解钾能力达到 18.56 mg/L.当装液量为 25 mL/250 mL,pH 6-8 范围内,分别以麦芽糖、蛋白胨为碳、氮源时,YM3 产IAA能力最佳.(2)玉米盆栽试验结果可见,与接种灭活菌相比,接种YM3 菌水剂的土壤IAA、速效磷、速效钾含量分别显著提高 75.00%、48.66%、20.00%.玉米幼苗的根长、根表面积、根体积、根尖数、根分枝数分别显著增加 67.95%、59.21%、51.13%、71.34%、92.06%.玉米植株的鲜重、株高、相对叶绿素含量、全氮、全磷、全钾分别显著提高了39.86%、23.51%、18.27%、17.68%、52.26%和 36.53%.(3)小麦玉米轮作大田试验结果表明,接种YM3 菌剂的小麦大田土壤有效氮、速效磷、速效钾分别显著增加了 9.08%、13.78%、16.66%,增产率达到 42.18%.玉米大田土壤速效磷和速效钾含量分别显著增加了 19.18%和 15.95%,增产率达到 13.22%.[结论]筛选得到的枯草芽孢杆菌YM3 菌株兼具产IAA、溶有机磷、解钾功能,在黄淮海平原小麦玉米轮作体系土壤中适应性强,广谱性强,能够提升砂质潮土土壤肥力,提高冬小麦-夏玉米轮作体系的产量.

土壤盐渍化是影响作物生长发育和产量的主要环境因素,利用土壤有益微生物治理盐渍化土壤是盐碱地改良的有效途径.本实验室前期从盐渍化土壤中筛选到两株耐盐菌株氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)C8 和嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)B4.菌株C8 具有解钾、溶有机磷和无机磷及产生长素的能力,菌株B4 具有溶有机磷和产生长素的功能.本文研究了C8 和B4 混合发酵对其功能的影响,结果表明,C8 和B4 混合培养后,其解钾、溶磷及产生长素的能力显著高于单一菌株.利用正交试验和响应面优化试验对其混合发酵培养基和培养条件进行优化,C8 和B4 混合发酵最适培养基配方为:葡萄糖 10 g/L,酵母膏 10 g/L,NaCl 4.5 g/L;最适培养条件为:pH 7.4,温度 28.8℃,转速 129 r/min,接种量 2%,装瓶量 20%,培养时间 23 h.以烟草为材料,检测复合菌剂对植株生长的作用,结果显示,盐胁迫下C8 和B4 复合菌剂处理显著促进植株生长.

磷是生物分子中的重要元素,是陆地生态系统初级生产的主要限制因子之一.全球粮食需求的增加和现代农业对磷肥的消耗导致集约农田中磷的过量输入,进而引起土壤磷流失的增加和地表水的持续富营养化.溶磷微生物(phosphate solubilizing microorganisms,PSMs)被认为是可以提高农业生产力的生态友好型肥料,在改善土壤肥力方面有重要意义.全面和深入理解 PSMs 功能及其在磷的土壤生物化学转化过程中的作用,对提高土壤磷有效性有至关重要的作用.本文系统综述了PSMs的种类和分布多样性,主要参与微生物磷循环的功能基因,以及PSMs如何参与土壤磷循环和这些过程背后的反应机制,以便更好地认识 PSMs 能力及其在土壤磷循环中的作用,以便于在未来的应用中发挥更大的潜力.

[背景]植物根际促生菌在促进植物生长、提高植物系统抗性及改善土壤养分状况等方面具有极大的应用潜力.[目的]为微生物菌肥的开发利用提供高效微生物资源.[方法]采用稀释涂布平板法分离烟草根际土壤可培养细菌,利用PVK培养基筛选具强溶无机磷活性的菌株,结合钼锑抗比色法测定菌株溶磷活性;利用Salkowski's比色液检测菌株产吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)活性;以菌株溶磷量和IAA产量为指标,采用单因素试验设计进行发酵条件优化,以得到菌株溶磷活性和产IAA的最佳发酵方案;基于种子促发芽及幼苗促生长试验验证菌株的促生效果;结合形态学、生理生化和 16S rRNA基因序列对菌株进行分类学鉴定.[结果]于烟草根际土壤分离得到 127 个不同分类的菌株,10 个菌株具溶无机磷的能力,其中菌株SH-1464 溶磷活性最强,溶磷圈直径为 16.11 mm,溶磷量为 119.22 mg/L;Salkowski's比色结果表明,菌株具有极强的产IAA活性,为 39.88 μg/mL.单因素试验结果表明,菌株SH-1464 溶磷的最佳碳源为 10 g/L葡萄糖,最佳氮源为 0.5 g/L蛋白胨,最佳无机磷源及其添加量为 2.5 g/L磷酸三钙,最佳初始pH值为 7.5,温度 30℃,转速 200 r/min;菌株SH-1464 产IAA最佳培养条件为:麦芽糖 10 g/L,酵母粉 5 g/L,NH4NO3 10 g/L,氯化钾 2.5 g/L,L-色氨酸 0.1g/L,pH 6.5,温度 30℃,转速 180 r/min.基于单因素试验结果进行优化前后菌株溶磷量及IAA产量对比试验可知,优化后菌株的溶磷量为 225.9 mg/L,提升 84.5%;IAA产量为 75.3 μg/mL,提升 88.8%.促生试验结果表明:菌株SH-1464 处理下番茄种子的发芽率提高 84.5%,株高提高 55.1%,茎围提高 32.5%,根长、根重分别提高 16.4%和 149%,地上部分鲜重和干重分别提高 172.2%和 203.6%.结合形态学和分子生物学鉴定菌株SH-1464 为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides,GenBank登录号为ON417365,保藏号为CCTCCM 2022924);此外,菌株还具有产蛋白酶、产纤维素酶、固氮、分泌铁载体的能力.[结论]菌株SH-1464 具有强溶无机磷、固氮、分泌 IAA、产蛋白酶、产纤维素酶及分泌铁载体等能力,可显著提高番茄种子的发芽率,对番茄幼苗株高、茎围、根长、根重、地上部分鲜重和干重等农艺性状具有显著促进作用,可作为高效微生物资源在微生物菌剂的开发利用等方面展现广泛应用前景.

[背景]菊科(Asteraceae)外来入侵植物欧洲千里光(Senecio vulgaris L.)来源于欧洲,广泛分布于我国西南和东北地区,在湖北高海拔山区也有分布.在入侵过程中,内生细菌可能在其获取氮磷营养方面起到了一些关键性作用.[目的]探究欧洲千里光内生固氮菌和溶磷菌的多样性和功能,为理解其入侵机制及防治提供参考.[方法]选择来自 6 个不同种群的种子,萌发后转移到花盆生长 6-8 周,并从每个种群中各挑选 9 株生长情况良好的植株,对其叶片和根组织表面进行消毒处理.使用基于 nifH 基因(固氮功能基因)的高通量测序方法对植物的固氮微生物群落结构和多样性进行研究.通过涂布平板法和平板划线法,在固体无氮培养基(Ashby)和无机磷培养基(inorganic phosphate,NBRIP)上对植物内生菌进行分离、纯化,对纯化的固氮菌株和溶磷菌株进行16S rRNA基因测序.采用钼锑抗比色法分析纯化溶磷菌株的溶磷能力.[结果]基于nifH基因的内生菌高通量测序结果表明,欧洲千里光叶样本中固氮菌多样性显著高于根样本;固氮菌群落中丰度最高的属是慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium,30.9%-34.0%),其次是伯克氏菌属(Burkholderia,27.2%-27.4%)、Methyloversatilis(2.1%-7.1%)和固氮螺菌属(Azospirillum,2.9%-3.9%);共 6 个门,其中变形菌门(Proteobacteria)在所有样本内相对丰度均达 90%以上.用Ashby培养基筛选得到 238 株纯菌,分布在 4 门 7 纲 10 目 16 科 19 属,其中丰度前 5 的优势菌属包括微杆菌属(Microbacterium,31.0%)、芽孢杆菌属(Bacillus,24.8%)、假单胞菌属(Pseudomonas,22.1%)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas,6.2%)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus,2.8%).用NBRIP培养基筛选共得到 318 株菌株,鉴定这些内生菌覆盖到 3门 5 纲 7 目 15 科 16 属,其中丰度前 5 的优势菌属包括芽孢杆菌属(48.4%)、假单胞菌属(19.2%)、微杆菌属(15.2%)、类芽孢杆菌属(3.6%)、不动杆菌属(Acinetobacter,3.6%).挑选了 24 株代表性菌株对溶磷能力进行了定性及定量检测,结果表明有 17 株具备显著的溶磷能力,而且细菌培养过程中培养基pH值下降.[结论]欧洲千里光内生固氮菌和内生溶磷菌具有丰富的多样性,并且溶磷菌具有一定的溶磷能力,在欧洲千里光的入侵过程中可能起着促进作用.

为了减少农业生产中化学肥料的使用,本研究利用无机磷培养基对富磷的茶树(Camellia sinensis L.)根际微生物进行筛选,获得一株对磷酸三钙具有高效降解能力的真菌菌株JL-1,经鉴定为产红青霉(Penicillium rubens).通过检测菌株JL-1 在溶磷过程中发酵液的pH值、磷含量和有机酸含量变化发现,该菌株在无机磷培养基中,发酵液pH值与葡萄糖酸含量、pH值与磷含量以及葡萄糖酸与磷含量分别呈显著负相关、显著负相关和显著正相关,且在电子显微镜下观察到磷酸三钙颗粒表面存在被侵蚀痕迹,深入分析发现菌株JL-1 通过分泌葡糖糖酸实现侵蚀磷酸三钙与溶磷的目的.通过单因素试验、Plackett-Burman设计试验、最陡爬坡试验和中心组合试验等一系列试验对培养条件进行优化发现,菌株JL-1 溶解磷酸三钙的最佳碳源和氮源分别是葡萄糖和硫酸铵.葡萄糖含量、磷酸三钙含量和温度是影响菌株JL-1 溶磷能力的主要因素,在葡萄糖 29.8 g/L,磷酸三钙 7.1 g/L,温度 31.9℃的条件下,菌株JL-1 在无机磷培养基中的溶磷能力达到最佳,溶磷量达到 1 194.15 mg/L,是初始值的近 3 倍.在缺磷土壤中,该菌株能显著促进小麦(Triticum aestivum L.)生长,其根长、株高和总鲜重分别提高 57.9%、36.4%和 42.9%,进一步说明产红青霉JL-1 具有良好的解磷、促生功能.菌株JL-1 优良的溶磷特性与溶磷能力为其在生物肥料方向的开发和应用提供了参考.