为探究湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的分子调控机制,该研究以灰毡毛忍冬 2 个品种花、茎和叶为材料,采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术和高通量转录组测序(RNA-seq)技术进行代谢组学和转录组学联合分析,筛选黄酮类差异代谢物、关键差异表达基因及相应转录因子,并随机挑选其中 14 条差异表达基因进行qRT-PCR验证.结果表明,代谢组学分析共筛选出黄酮类化合物生物合成相关途径差异代谢物 17 个,包括柚皮苷查尔酮、芹菜素、槲皮苷等;转录组学分析共筛选出黄酮类化合物生物合成相关途径差异表达基因19条,包括2条CHS、3条CHI等;调控网络分析和加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选出调节黄酮类成分积累的关键酶基因CHS1、FLS1和HCT;同时发现MYB12和LBD4 这2个转录因子可能通过调控关键酶基因CHS1、FLS1和HCT的表达来调控黄酮类成分的生物合成;qRT-PCR结果显示,随机选取的 14 个差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果基本一致.该研究初步解析了2个品种灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的转录调控机制,为进一步阐明其中关键酶基因及相应转录因子对灰毡毛忍冬黄酮类成分积累的调控作用奠定基础.

目的 鉴定灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并进行生物信息学分析与表达模式验证,克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬MADS-box家族成员CMB1 全长.方法 基于转录组数据,利用在线工具对灰毡毛忍冬MADS-box进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR验证MADS-box基因在不同品种中的表达模式,通过RT-PCR、RACE技术克隆湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬CMB1基因全长.结果 28个灰毡毛忍冬MADS-box蛋白长度为89～359 aa,碱性蛋白占比85.7%,不稳定蛋白占比96.4%,亲水性蛋白占比 96.4%,均定位于细胞核,均为无跨膜结构的非分泌蛋白.转录组显示,与野生型比较,湘蕾型中 28个MADS-box基因有 17.86%表达下调,MIKCC型基因中有 18.75%表达下调.克隆得到在两个品种的灰毡毛忍冬花中高度特异性表达的CMB1基因全长,均包含一个738 bp的ORF,编码245个氨基酸.CMB1基因在两个品种的花中表达量存在显著差异(P<0.01),且与茎、叶相比,在花中高度特异性表达(P<0.01).结论 基于灰毡毛忍冬转录组数据,鉴定了 28个MADS-box家族基因,克隆得到湘蕾型与野生型灰毡毛忍冬CMB1 基因全长,为进一步研究灰毡毛忍冬花发育、优良表型形成的分子机制提供研究基础与理论依据.

目的 克隆灰毡毛忍冬bZIP25 基因序列全长,并进行生信分析及表达模式分析,以初步探索其在灰毡毛忍冬中的生物学功能.方法 通过逆转录PCR技术克隆bZIP25 基因的序列全长,采用生物信息学分析方法对bZIP25及其编码的蛋白进行分析.运用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)技术测定其在茎、叶及七个花期花中的表达水平.结果 克隆得到 LmbZIP25 基因(OR551766),其编码 191 个氨基酸,具有典型的 bZIP 家族结构,在 bZIP 结构域中与其他植物同源性较高.LmbZIP25 基因具有组织特异性,在茎中的表达量显著高于花和叶,在七个花期中黄色花蕾期的表达量最高.结论 克隆得到 LmbZIP25 基因全长,分析其在不同器官和不同花期的表达差异,为进一步探索其在灰毡毛忍冬中花发育中的功能奠定了研究基础.

目的 利用超高效液相-四极杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术分析脉络宁注射液酯提废渣的化学成分,为酯提废渣资源的再利用提供科学依据.方法 利用ASD-7大孔树脂柱富集脉络宁注射液酯提废渣化学成分,采用UPLC-Q-TOF-MS技术对脉络宁注射液酯提废渣大孔树脂富集液进行数据采集和化学成分鉴定,采用定量软件对绿原酸、异绿原酸、异绿原酸C、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙进行含量测定.结果 共鉴定出脉络宁注射液酯提废渣中42个化学成分,包括9个酚酸类化合物、9个黄酮类化合物、10个环烯醚萜类化合物、8个三萜皂苷类化合物、5个苯丙素类化合物和1个联苄类化合物,定量分析结果显示绿原酸、异绿原酸、异绿原酸C、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙在考察的浓度范围内与峰面积线性关系良好(r＞0.9990),精密度、重复性和稳定性良好,加样回收率为95.38％～103.06％,RSD为0.76％～1.8％.结论 本研究可用于脉络宁注射液酯提废渣大孔树脂富集液中化学成分的鉴定以及5种有效成分的准确定量分析,为脉络宁注射液酯提废渣的再利用和制备工艺奠定基础.

目的 克隆获得灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP),并对其进行生物信息学、时空表达特异性和蛋白原核表达等特性分析.方法 根据灰毡毛忍冬转录组数据设计特异性引物,通过PCR技术克隆LmSVP基因全长;运用生物信息学方法分析其编码蛋白的序列特征;利用实时荧光定量技术(reverse-transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测该基因在灰毡毛忍冬2个品种"龙花"和"金翠蕾"叶片、花早期和晚期中的表达水平;最后构建pTOPO-D1-LmSVP原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达.结果 LmSVP基因全长1472 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长720 bp,编码239个氨基酸,蛋白质相对分子质量为26 712.63.进化树分析表明,LmSVP蛋白与中华猕猴桃、小粒咖啡的SVP蛋白亲缘关系最近.qRT-PCR结果显示,LmSVP基因在"龙花"和"金翠蕾"品种中的表达均存在组织特异性表达,其在叶中的表达量显著高于花中;而在花发育不同时期,LmSVP基因表达量没有明显差异.LmSVP在大肠杆菌中成功表达出蛋白,蛋白表达结果显示其相对分子质量约为26 710,与预测相符合.结论 通过对LmSVP基因的全长克隆、序列分析和表达特性鉴定,为进一步研究该基因在调控花蕾型灰毡毛忍冬蕾期长及花冠不开放的功能提供实验基础.

目的 建立UPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定连花清瘟胶囊(颗粒)中连翘苷、连翘酯苷A、绿原酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、(R,S)-告依春、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、红景天苷、甘草苷、甘草酸铵,以及山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量.方法 该药物 40%甲醇提取液的分析采用 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流动相(5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温35℃;电喷雾离子源;正负离子模式扫描;多反应监测模式.结果 19 种成分在各自范围内线性关系良好(r＞0.999 0),平均加样回收率89.37%～102.19%,RSD 2.03%～3.75%.各批样品均未检出灰毡毛忍冬皂苷乙.结论 该方法简便、准确、高效,可用于连花清瘟胶囊(颗粒)的质量控制及山银花的掺伪鉴别.

目的 分别克隆灰毡毛忍冬与忍冬HQT2 基因全长序列,并进行生物信息学和表达量分析,以揭示HQT2 在灰毡毛忍冬与忍冬绿原酸生物合成中的可能功能.方法 多糖多酚试剂盒法分别提取灰毡毛忍冬与忍冬花总RNA,通过RT-PCR和RACE技术克隆HQT2基因的全长cDNA序列,运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分别测定灰毡毛忍冬与忍冬茎、叶及不同花期花中相关基因的相对表达量;采用HPLC 测定绿原酸含量并结合表达量做相关性分析.结果 克隆得到LmHQT2(MH196564)和LjHQT2(MK294639),其开放阅读框长度均为 1 296 bp,编码 431 个氨基酸,生物信息学分析预测为亲水性蛋白,可能定位于细胞质中,属于氯霉素乙酰转移酶样结构域超家族;qRT-PCR结果显示,HQT2基因具有组织特异性,在灰毡毛忍冬与忍冬茎、叶及不同花期花器官中表达存在差异;绿原酸含量与基因相对表达量之间呈现一定的相关性.结论 本研究成功克隆了灰毡毛忍冬与忍冬HQT2基因并探索其在不同器官中的表达模式,推测HQT2 基因在灰毡毛忍冬与忍冬的绿原酸生物合成途径中发挥不同功能,为进一步研究该基因的功能及探究灰毡毛忍冬和忍冬绿原酸生物合成调节机制提供了研究基础.

目的 研究不同发育阶段灰毡毛忍冬花部的挥发油含量和品质.方法 采用水蒸气蒸馏法提取不同发育阶段开花型和闭蕾型灰毡毛忍冬花部的挥发油,使用GC-MS联用仪对挥发油进行成分分析鉴定,并用面积归一法测定挥发油各成分的百分含量.结果 开花型和闭蕾型灰毡毛忍冬花部不同发育阶段挥发油的含量和成分存在明显差别.开花型在大白期挥发油含量最高,挥发油化学成分种类最多.闭蕾型在黄白期挥发油含量最高.结论 根据挥发油含量及其成分变化,确定灰毡毛忍冬花部适宜采收期,开花型为大白期,闭蕾型为黄白期.

目的 探讨不同产地初加工方法对黔产灰毡毛忍冬外观性状、品质成分和加工效率多方面的影响,为灰毡毛忍冬产地加工方法的优选提供依据.方法 采用传统加工方法组(晒干、蒸后晒干、阴干、蒸后阴干)、恒温烘干组(50、60、70、80℃)、变温烘干组(50→60℃、50→70℃、50→80℃)共11种方法加工灰毡毛忍冬,对加工品从颜色和香气等外观指标,水分、总灰分、酸不溶性灰分、绿原酸、总皂苷等成分指标,加工时间和折干率等效率指标分别进行测定.结果 综合外观性状、品质成分和加工效率多方面的因素,11种加工方法中,50℃恒温和变温方法的综合关联度值在0.94～0.96,远高于其他方法,其中50→60℃方法的综合关联度值最高,达到了0.959 8.结论 综合来看,变温干燥是灰毡毛忍冬较好的产地初加工方法,该方法可作为基地规模化加工灰毡毛忍冬的重要技术手段.

目的:建立HPLC指纹图谱及一测多评同时检测泸州古蔺山银花中9个成分的质量分析方法.方法:以绿原酸为参照物,建立泸州古蔺山银花HPLC指纹图谱,并采用斜率校正法计算其与新绿原酸、隐绿原酸、獐牙菜苷、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙及川续断皂苷乙的相对校正因子,分别用外标法和一测多评法计算含量.结果:建立了10批古蔺山银花HPLC指纹图谱,相似度均在0.99以上,标定了11个共有峰,指认了其中9个共有峰,并分别采用外标法和一测多评检测其含量,二者无显著差异.结论:实验将一测多评和指纹图谱相结合评价泸州古蔺山银花的质量,该方法准确、简便、可行,为更全面控制山银花的质量提供参考依据.