目的:利用高分辨气相色谱-四级杆-静电轨道阱质谱法(GC-Q-Exactive-MS)定性分析灵芝孢子油的化学成分.方法:采用GC-Q-Exactive-MS,在电子轰击(EI)源下获取化合物的全扫描质谱数据,通过总结脂肪酸类、萜类、甾醇类及醛类化学成分的质谱裂解规律,并检索NIST、MassBank、HMDB、PubChem在线数据库及查阅相关文献,对灵芝孢子油的各类化学成分进行鉴定.结果:从灵芝孢子油中共鉴定了 22 个化学成分,包括 3 个脂肪酸类、4 个萜类、4 个甾醇类、4 个醛类及 7 个其他类化合物.结论:研究结果为灵芝孢子油质量控制和中药弱极性化学成分定性分析提供了参考.

为准确测定灵芝孢子粉产品的酸价,阐明影响酸价的关键因素,本试验建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测器(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector,HPLC-ELSD)分析方法测定孢子油中游离脂肪酸的含量.通过优化色谱条件,建立了亚油酸、棕榈酸和油酸的HPLC的定量测定方法.该方法精密度、重复性和稳定性好,可用于灵芝孢子粉、孢子油及其相关产品中亚油酸、棕榈酸和油酸成分的定量测定.与国标化学法测定的结果比较,两种方法的匹配度较好,HPLC-ELSD 法灵敏度高,可以测定不同脂肪酸的含量.通过比较分析发现,贮存时间对破壁灵芝孢子粉脂肪酸影响最大,同时产地和采收时间也影响酸价的大小.对 8 种不同品牌市售灵芝孢子油产品的脂肪酸含量测定,发现脂肪酸含量相差较大,其中含量最高的为(99.81±10.21)mg/g,最低的为(1.90±0.12)mg/g.因此新建立的HPLC-ELSD法可精确定量灵芝孢子粉中游离脂肪酸,为市场上灵芝孢子类产品的质量控制提供科学依据.

目的 制备不同粒径灵芝孢子油自微乳给药系统并对其质量进行评价.方法 通过优化处方工艺制备不同粒径的灵芝孢子油自微乳,并对其外观、粒径、电位、自乳化时间、载药量以及稳定性等进行考察;采用高效液相色谱法建立灵芝孢子油自微乳的质量评价方法.结果 4种不同处方的灵芝孢子油自微乳粒径分别为(27.3±1.2)、(91.1±2.5)、(142.8±2.1)、(202.6±3.4)nm,相应的电位分别为(-12.1±0.5)、(10.8±0.7)、(-12.3±0.6)、(-11.2±1.0)mV;高温和高强光实验显示,4组不同粒径的灵芝孢子油自微乳体系质量稳定.结论 自制的不同粒径灵芝孢子油自微乳质量稳定可控.

探讨灵芝孢子油对于不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性差异,选取人肝癌细胞(HepG2)、人非小细胞肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)为待检测肿瘤细胞株,采用MTT法进行细胞活力检测,Western blot法检测NF-κB信号通路激活程度,Caspase-3活性检测法检测Caspase-3酶活性来对灵芝孢子油的抗肿瘤活性机制进行初步探讨,并对3种肿瘤细胞的抗肿瘤活性进行比较.经MTT细胞活力实验验证,发现灵芝孢子油对3种肿瘤细胞的生长均具有一定抑制作用,其抑制强度依次为A549细胞、HepG2细胞、HCT116细胞;Western blot检测结果显示,灵芝孢子油能促进NF-κB通路的激活,3种肿瘤细胞比较下,A549细胞NF-κB信号通路激活程度最强,其次为HepG2细胞,对HCT116细胞作用最弱;Caspase-3活性检测结果显示,灵芝孢子油能激活Caspase-3依赖的凋亡相关途径,其中对A549细胞Caspase-3酶激活程度最强,对HepG2细胞作用较强,对HCT116细胞作用最弱.因此,本研究发现,灵芝孢子油对3种肿瘤细胞的生长均具有一定抑制作用,其抗肿瘤活性呈时间剂量依赖性,其机制可能与激活NF-κB通路与Caspase-3凋亡途径加速肿瘤细胞凋亡坏死相关.3种肿瘤细胞生长抑制实验结果显示,灵芝孢子油对A549细胞的抗肿瘤活性最明显,其次为HepG2细胞,对HCT116细胞的抗肿瘤活性最弱.

破壁灵芝孢子粉为一种灵芝深加工产品,具有多种药理学活性,更易被人体吸收.灵芝孢子的破壁方法包括生物化学法、物理法和机械法等,工业生产多综合利用多种方法.破壁灵芝孢子粉的质量分析还没有统一的国家标准,灵芝孢子粉质量可以参考地方标准进行综合评价,还可以参考近期发表的一些分析方法.灵芝孢子粉提取物产品以孢子油为主,其它产品也有研发并推出市场.药理学研究表明,灵芝孢子油、灵芝孢子粉水提物和醇提物均具有抗癌活性,有良好的应用前景.

为准确测定灵芝孢子粉中三萜的含量,运用高效液相建立适合孢子粉的分析测定方法.通过对前处理条件的优化,确定40％乙醇为孢子粉中等极性三萜酸类的最佳提取溶剂,浓缩倍数是子实体提取条件的50倍.通过色谱柱和洗脱条件的优化,建立了包括灵芝酸l、灵芝烯酸C、灵芝酸C2等13种标准品测定方法,方法学考察显示该分析方法精密度、重复性、稳定性的RSD值均小于5％,可以用于灵芝孢子粉中三萜类成分的定量检测.通过5组样品的分析发现,灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝酸F是灵芝孢子粉中的主要三萜类成分,其中灵芝酸A含量最高,平均占样品三萜总量的比例达19.71％;三萜类成分的溶出量与是否破壁没有相关性.三萜类成分在灵芝孢子粉和灵芝孢子油产品中的含量非常低,孢子粉的三萜含量为14.24-99.70μg/g,仅为子实体的1/100,灵芝孢子油中三萜含量也均低于50μg/g,因此三萜类成分不适合作为灵芝孢子粉及其相关产品的定量检测指标.

灵芝在中国有近千年的使用历史,在传统中药中被列为上品,其养生保健作用被历代医家认可.近年来,灵芝可用部位不断被挖掘,在保健食品中的可用部位原料包括灵芝子实体、灵芝孢子粉、灵芝孢子油和灵芝菌丝体.截至2018年底,已批准含有上述可用部位的保健食品数量达到1270余个.本研究首次系统地对1997年以来批准的灵芝类保健食品进行分类梳理总结.首先对每个可用部位的单方和复方产品批准情况分别统计;再对灵芝传统使用部位的复方保健食品配方配伍进行分析;最后以灵芝为例,分析了已批准中药类保健食品的现状,提出未来中药类保健食品发展方向.

运用高效液相建立灵芝孢子粉中脂溶性成分的分析测定方法.通过色谱柱、洗脱条件、ELSD参数的优化,建立了12种脂溶性成分的测定方法,结果表明,该方法简单、准确、稳定,可以实现孢子粉中甘油三酯、脂肪酸、甾醇三类脂溶性成分的同时提取、分析;破壁孢子粉中脂溶性成分为301.49-397.37mg/g,孢子油产品中脂溶性成分的含量为626.00-713.07mg/g,远高于三萜含量;1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯、甘油三油酸酯、1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯是主要的脂溶性成分,脂肪酸以不饱和脂肪酸亚油酸及油酸为主,甾醇中麦角甾醇含量最高.研究结果明确了灵芝孢子粉中脂溶性成分的物质基础,为深入研究其活性成分、全面评价孢子粉质量提供了依据.

目的 探讨灵芝孢子油、破壁灵芝孢子粉及灵芝孢子提取物对小鼠急性胃溃疡的影响.方法 雄性ICR小鼠随机分为12组:对照组,模型组,奥美拉唑(阳性药,4 mg·kg-1)组,灵芝孢子提取物低、中、高剂量(0.2、0.4、0.8 g·kg-1)组,破壁灵芝孢子粉低、中、高剂量(0.6、1.2、2.4 g·kg-1)组,灵芝孢子油低、中、高剂量(0.2、0.4、0.8 g.kg-1)组,每组20只.ig给药,每天1次,对照组和模型组给予等体积的生理盐水.连续给药7d后,禁食12 h,除对照组外,每组随机选取10只小鼠ig无水乙醇(10 mL·kg-1)建立急性胃溃疡模型,1.5 h后取材;每组余下10只小鼠ig吲哚美辛(40 mg·kg-1)建立急性胃溃疡模型,3h后取材.观察小鼠的一般状况、胃出血和溃疡情况,进行胃损伤评分,计算损伤抑制率和损伤发生率.结果 各组小鼠给药过程中无异常.小鼠给予无水乙醇后,模型组和奥美拉唑组10 min后开始出现行动变缓,肢体活动不协调,呼吸加深、频率减慢等症状,而给予灵芝孢子提取物、破壁灵芝孢子粉和灵芝孢子油的小鼠在30 min后才陆续出现症状;给予吲哚美辛的小鼠自主活动减少,各组之间无差别;对照组小鼠行为活动如常.与对照组比较,小鼠经无水乙醇、吲哚美辛ig导致非常明显的胃溃疡,胃损伤评分显著升高(P＜0.01),损伤发生率为100％;与模型组比较,预防性给予灵芝孢子提取物、破壁灵芝孢子粉、灵芝孢子油可明显降低胃出血或溃疡等胃黏膜损伤,其中灵芝孢子提取物高剂量组、破壁灵芝孢子粉组、灵芝孢子油组的胃损伤评分显著降低(P＜0.01),损伤抑制率显著提高(P＜0.01),损伤发生率明显降低.结论 灵芝孢子油、破壁灵芝孢子粉及灵芝孢子提取物能有效抑制小鼠急性胃溃疡的发生,灵芝孢子油效果最佳,破壁灵芝孢子粉次之,并且对于无水乙醇导致的急性胃溃疡抑制作用尤为显著.

目的 探讨灵芝孢子类产品对模型小鼠肝损伤的改善作用.方法 将42只小鼠随机分为空白对照组[等体积0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)]、模型组(等体积0.5％CMC-Na)、破壁灵芝孢子粉组(破壁组,0.1 g/kg)、富硒破壁灵芝孢子粉组(富硒破壁组,0.1 g/kg)、灵芝孢子油组(孢子油组,0.1 g/kg)、未破壁灵芝孢子粉组(未破壁组,0.1 g/kg),各7只.尾静脉注射0.25 mg/mL刀豆蛋白A,以复制肝损伤小鼠模型,正常对照组给予等体积生理盐水,隔天1次,连续2周;建模成功后各组小鼠灌胃相应药物或0.5％CMC-Na,每天1次,连续30 d.采用苏木素-伊红(HE)染色,观察小鼠肝组织形态学变化;检测小鼠血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的水平.结果 与模型组比较,破壁组、富硒破壁组、孢子油组小鼠的肝细胞坏死程度均显著减轻,肝索排列较规范,炎性程度减轻;未破壁组小鼠肝细胞坏死程度虽减轻,但坏死处仍有炎性细胞浸润.与模型组比较,破壁组、富硒破壁组、孢子油组、未破壁组小鼠血清中AST,ALT,TNF-α,IFN-γ 水平及肝组织中MDA水平均显著降低,肝组织中SOD水平均显著升高(P<0.05).结论 上述4种灵芝孢子类产品具有一定的保肝护肝作用,其机制与修复损伤肝细胞、促进肝细胞生长、抗氧化和免疫调节相关.