目的:探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。方法:分离人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的细胞外囊泡（EVs）。构建甲氨蝶呤（MTX）载药囊泡（MTX-EVs）并通过扫描电镜及动态光散射仪（DLS）对构建的载药囊泡进行形态大小分析，通过蛋白质印迹法对其表面特异性蛋白进行鉴定。选取4~5周C57BL/6J雄性小鼠40只，通过盲抓法随机抽取其中8只不做处理，正常饲养作为对照组（由第四军医大学实验动物中心提供），其余小鼠利用脂多糖（LPS）（2 g/L，5 μl）牙周局部注射诱导小鼠牙周炎模型，间隔1天注射1次，诱导2周。将成功诱导牙周炎模型小鼠通过盲抓法随机分为4组，每组8只。分别为LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组。牙周局部治疗2周后，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测牙龈组织炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的质量浓度。通过显微CT（micro-CT）、HE染色评估对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠的牙槽骨吸收情况。流式细胞仪分析牙龈组织中γ干扰素（IFN-γ）阳性细胞的占比。结果:扫描电镜结果显示EVs和MTX-EVs呈圆形或椭圆形，DLS粒径分析证明EVs粒径在200 nm左右，MTX-EVs粒径在300 nm左右。ELISA结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度分别为（28.86±2.76）、（51.50±2.04）、（35.26±2.40）、（45.49±2.04）、（35.77±3.49）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度显著低于LPS+EVs组（ P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度分别为（125.44±4.12）、（221.64±10.59）、（178.16±16.90）、（181.09±18.22）、（170.15±9.04）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度显著低于LPS+EVs组和LPS+MTX组（均 P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度分别为（320.27±38.68）、（479.62±40.94）、（342.18±25.89）、（415.88±12.01）、（325.75±30.83）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度显著低于LPS+EVs组及LPS+MTX组（均 P<0.05）。micro-CT扫描结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠右上颌第一磨牙第一牙根处釉质牙骨质界到牙槽嵴顶的距离分别为（0.11±0.03）、（0.28±0.02）、（0.23±0.03）、（0.20±0.04）、（0.18±0.03）mm，与LPS组相比，LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组骨吸收均得到不同程度的抑制，差异均有统计学意义（均 P<0.05），其中LPS+MTX-EVs组与LPS+MTX组及LPS+EVs组相比，骨吸收抑制效果最好，且差异均有统计学意义（均 P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示，LPS组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IFN-γ阳性细胞占比分别为（11.77±1.02）%、（6.87±0.65）%及（4.15±0.92）%，LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比均显著低于LPS组（均 P<0.05），LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比显著低于LPS+EVs组（ P<0.05）。 结论:MTX-EVs可有效改善牙周炎模型小鼠牙周局部炎症环境，减少小鼠牙槽骨骨吸收。

目的:探究Wnt3a对人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）增殖、迁移和成骨分化的影响，确定Wnt3a对小鼠实验性牙周炎牙槽骨再生的作用。方法:分别用不同质量浓度的Wnt3a（0、20、100、200、500 μg/L）刺激PDLSC（计为5组），培养2、4、7或10 d后通过细胞计数检测细胞增殖，通过Transwell实验检测细胞迁移；培养21 d时通过实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原、runt 相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）的表达情况。将Wnt3a蛋白包裹在聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球复合透明质酸水凝胶中，注入牙周炎小鼠的龈沟中。在1、2、4和8周取上颌牙槽骨样本，用显微计算机断层扫描、HE染色及骨形成标志物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runx2和骨钙蛋白免疫组化染色评估牙槽骨再生情况。结果:培养10 d后，与0 μg/L Wnt3a组相比，Wnt3a在20~500 μg/L时均可显著促进PDLSC增殖（ P<0.01）。培养21 d时，0、20、100、200及500 μg/L组Ⅰ型胶原mRNA的表达量分别为0.96±0.27、1.90±0.47、2.18±0.24、2.32±0.15、1.99±0.43，Runx2 mRNA的表达量分别为1.08±0.15、3.19±0.17、6.19±0.28、9.19±0.41、5.55±0.06，Ⅰ型胶原和Runx2 mRNA的表达与0 μg/L Wnt3a组相比差异均有统计学意义（ P<0.05）。在注射水凝胶第1、2、4、8周后，包裹Wnt3a的水凝胶组小鼠上颌第二磨牙颊侧釉质牙骨质界至牙槽嵴顶的距离［分别为（497.3±18.2）、（455.7±12.5）、（401.0±8.5）、（362.3±15.5） μm］与牙周炎组小鼠［分别为（710.3±10.2）、（614.0±16.4）、（564.3±12.5）、（502.3±6.8） μm］相比均显著减少（ P<0.01），牙周炎症减轻。注射水凝胶4周后免疫组化结果显示，与牙周炎组相比，Wnt3a水凝胶组成骨相关基因ALP（0.72±0.01）、Runx2（0.77±0.03）及骨钙蛋白（0.72±0.07）的表达水平均显著升高（ P<0.01）。 结论:Wnt3a可以促进PDLSC的增殖、迁移和成骨分化以及实验性牙周炎小鼠的牙槽骨再生。

目的:研究孕期尼古丁暴露对子代小鼠牙釉质形成的影响及其可能的表观遗传学机制。方法:通过随机数字表法将10只C57BL/6孕鼠分为对照组（皮下注射生理盐水）及孕期尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure，PNE）组（皮下注射尼古丁溶液），每组5只，孕鼠生产后分别收集出生后0 d（postnatal day 0，P0；P14、P25含义依此类推）、P14、P25新生小鼠，根据母代分组分为子代对照组及子代PNE组，并记录P0、P25子代小鼠体质量。采用显微CT（micro-CT）扫描分析、扫描电镜和维氏显微硬度检测对子代小鼠牙槽骨和下颌切牙进行硬组织相关参数分析。提取P25子代小鼠下颌骨组织及第3代牙上皮干细胞（dental epithelial stem cell，DESC）中的总RNA，通过实时荧光定量PCR检测成骨向及成釉向分化相关基因、增殖相关标志物和干细胞标志物的表达水平。采用石蜡切片免疫组织化学染色观察增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，Pcna）、釉原蛋白（amelogenin，Amelx）、甲基转移酶ZESTE增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，Ezh2）、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（histone H3 trimethylated at lysine 27，H3K27me3）阳性染色分布及水平。使用细胞增殖（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒对外源性添加不同浓度（0.01、0.1、1 mmol/L）尼古丁以及Ezh2抑制剂GSK126的DESC进行细胞活力检测。结果:PNE组孕鼠较对照组更容易出现不良妊娠结局，P0时子代PNE组小鼠体质量［（0.99±0.02）g］显著低于子代对照组［（1.20±0.04）g］（ P<0.001）；P25时，子代PNE组小鼠体质量［（9.65±1.32）g］显著低于子代对照组［（15.26±1.70）g］（ P<0.001），死产率［（46.40±9.30）%］显著高于对照组（0）（ P<0.001）。P14和P25时，子代PNE组小鼠下颌切牙釉质矿化沉积点与第一磨牙近中面的距离数值［分别为（-1 349±45）、（-506±380）μm］均较子代对照组［分别为（-1 192±147）、（504±198）μm］显著减小（ P<0.05， P<0.001），提示矿化沉积点延迟。子代PNE组小鼠切牙釉柱及釉柱间质较对照组排列松散无序，显微硬度［（245.7±18.4）MPa］较子代对照组［（371.9±28.7）MPa］显著降低（ P<0.001）。HE染色显示子代PNE组小鼠前成釉细胞（pre-ameloblast，Pre-Am）区域排列较对照组紊乱，矿化沉积点推迟，暂时性扩增细胞（transit-amplifying cell，TA）及Pre-Am区域延长。免疫组织化学染色显示，子代PNE组小鼠唇侧颈环（labial cervical loop，LaCL）整体Pcna表达较子代对照组显著增多（ P<0.05），H3K27me3较对照组显著富集（ P<0.01），对应区域可见Ezh2表达显著增加（ P<0.01），同时成釉细胞胞质中Amelx阳性信号减弱。体外实验添加1 mmol/L 尼古丁能显著上调子代PNE组DESC的Pcna基因表达水平（ P<0.01），同时显著下调DESC标志物B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1、富亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1和成釉细胞向分化的相关基因Amelx等的基因表达水平（ P<0.05， P<0.05， P<0.01）。此外，与0 h时相比，干预24 h后1 mmol/L尼古丁可显著增强DESC的增殖活性（ P<0.001），添加10 μmol/L Ezh2抑制剂GSK126可挽救1 mmol/L尼古丁对DESC带来的增殖促进作用。 结论:孕期尼古丁暴露可能导致成釉向谱系定向分化过程延迟，致子代小鼠DESC增殖及分化异常，并且影响H3K27me3表观遗传修饰水平，造成子代牙釉质发育障碍，提示孕期尼古丁暴露是牙发育的危险环境因素。

来源于牙相关组织的干细胞是口腔范围内特有的干细胞,对牙槽骨丢失后的再生或修复及牙槽骨的改建等具有重要意义.长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被发现参与牙相关组织干细胞的成骨向分化.本文就lncRNA在牙相关组织来源干细胞成骨分化过程中发挥的作用、调控的靶点及具体机制的最新研究进展进行综述.

目的 探究被动吸烟及戒除被动吸烟后大鼠血液及口腔硬组织中的尼古丁分布情况和变化规律,并通过体外尼古丁对牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖及成骨能力的影响,间接证实口腔组织中尼古丁沉积的危害.方法 建立被动吸烟大鼠模型,采用液相色谱-串联质谱法检测大鼠血液、牙齿和牙槽骨中尼古丁分布情况.体外尼古丁刺激PDLSCs,通过CCK-8、茜素红染色、Western Blot检测尼古丁对PDLSCs增殖能力和成骨能力的影响.结果 在为期3个月的被动吸烟中,大鼠血液、牙槽骨,牙齿中的尼古丁浓度分别在2月、1月、2月达到峰值,随后逐渐降低;戒除被动吸烟后,尼古丁仍维持一定浓度水平.体外尼古丁刺激PDLSCs后,细胞增殖受到抑制,矿化结节显著减少,ALP、Runx2、OPG等蛋白表达均下调.结论 尼古丁在被动吸烟大鼠血液、牙齿和牙槽骨中的分布情况具有时间相关性,戒除被动吸烟后,尼古丁可长期蓄积于体内,对牙周膜干细胞的增殖和成骨分化产生不利影响.

目的:探究PF-127 水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源 miR-132 诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用.方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒.制备BMSCs来源外泌体(bone mesenchymal stem cells-exosomes,BMSCs-exo),蛋白质印迹法鉴定表达标志物.制备PF-127 水凝胶和BMSCs-Exo 复合物,PKH67 标记法检测BMSCs的摄取;茜素红染色检测 BMSCs 的成骨能力;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcrip-tion-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测细胞中 miR-132 表达和碱性磷酸酶(alkaline phospha-tase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt 相关转录因子 2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA表达.建立牙槽骨缺损大鼠模型,将大鼠随机分为 PF-127 水凝胶组、PF-127 水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127 水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132 组.微型计算机断层扫描(Micro-computed tomography,micro-CT)评估牙槽骨缺损情况;蛋白质印迹法检测牙槽骨组织中 ALP、OCN、Runx2 蛋白表达.结果:anti-miR-132 组 BMSCs 中 miR-132 表达明显低于 anti-miR-NC 组(P<0.05),提示anti-miR-132 成功转染至BMSCs中.BMSCs-exo-anti-miR-NC组和BMSCs-exo-anti-miR-132 组中外泌体标志物CD9 和CD63 显著表达.和BMSCs-exo-anti-miR-NC 组相比,BMSCs-exo-anti-miR-132 组中miR-132 表达明显降低(P<0.05).和PF127 水凝胶组相比,BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127 水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127 水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132 组中miR-132表达均明显降低,茜素红染色相对活性、细胞中 Runx2、ALP 和 OCN mRNA 表达均明显增加,且 PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132 组变化最显著(P<0.05).和Control组相比,PF-127 水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127 水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132 组BV/TV比值、BMD、Tb.N和Tb.Th及细胞中Runx2、ALP、OCN蛋白表达均明显升高,Tb.Sp 明显降低(P<0.05),且 PF-127 水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132 组变化最显著.结论:PF-127 水凝胶联合骨髓间充质干细胞来源外泌体来源干扰miR-132 表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进牙槽骨缺损大鼠的修复.

目的 目前针对牙槽骨不规则缺损的修复尚无行之有效的治疗手段.制备一种包裹牙周膜干细胞和二甲双胍的磷酸钙(CPC)-微纤维(aMF)支架,评价其理化性能以及体外成骨效果,并分析其用于临床进行骨缺损修复的可能性.方法 将磷酸四钙与无水碳酸氢钙混合制备磷酸钙骨水泥,将藻酸钠在7.5%的氧化条件下降解,将上述支架材料混合后,包裹牙周膜干细胞和二甲双胍,制备出CPC-aMF骨缺损修复支架.通过扫描电镜以及光学显微镜,对该支架进行初步理化性能和表面形貌的表征.最后通过碱性磷酸酶等成骨分化实验确定该支架的成骨效果.结果 在该支架的表面形貌表征中发现,CPC提供了支撑结构,aMF作为其内包裹的细胞和生长因子保护.这种新型支架显示了良好的成骨性能,碱性磷酸酶半定量检测发现包裹牙周膜干细胞和二甲双胍的CPC-aMF支架的成骨效果是对照组的2.5倍,qT-PCR检测结果发现实验组的成骨效果是对照组的2.5倍.结论 新型的骨缺损支架为治疗大面积骨缺损提供了一种潜在的治疗性骨组织工程策略.

研究牙周组织再生可为牙槽骨缺损提供可能的临床应对策略,牙周膜干细胞作为重要的种子细胞在牙槽骨修复中发挥着重要的作用.长链非编码RNA可作为竞争性内源性RNA在转录后水平发挥重要调控作用.该文就长链非编码RNA介导微小RNA对牙周膜干细胞在生理状态、炎症微环境以及力学刺激下的成骨分化机制进行综述.

目的 探究骨髓间充质干细胞外泌体通过调控NLRP3炎性小体信号通路影响糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合相关分子机制.方法 选取50只SD大鼠纳入研究,随机选取10只大鼠作为对照组,其余大鼠构建糖尿病+双侧上颌牙槽骨缺损模型,设置模型组、骨髓间充质干细胞外泌体组(BMMSC-Exos组)、MCC950组(NLRP3抑制剂)、BMMSC-Exos+MCC950组,其中BMMSC-Exos组、MCC950组、BMMSC-Exos+MCC950组SD大鼠分别尾静脉注射BMMSC-Exos及MCC950试剂,模型组注射等量盐水.模型构建28 d后取大鼠上颌骨组织.TEM检测BMMSC-Exos形态,Western blot检测BMMSC-Exos标志性蛋白CD9、CD63、CD81表达.检测各组大鼠空腹血糖水平、HE染色分析各组大鼠牙槽骨炎性浸润及Lance-Sandhu评分;Western blot检测各组大鼠牙槽骨组织内NLRP3炎性小体信号通路关键蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β)、骨代谢关键蛋白(OPG、ALP、Collal)表达.结果 BMMSC-Exos直径大小在100 nm左右,呈双凹圆盘状态,膜结构完整;与纯BMMSCs相比,BMMSC-Exos标志物蛋白CD9、CD63、CD81的含量表达明显提升(P<0.05).糖尿病大鼠模型建立成功,BMMSC-Exos干预、NLRP3抑制剂(MCC950)下调大鼠血糖水平(P<0.05);两者联合可以进一步下调大鼠血糖水平(P<0.05);与对照组相比,糖尿病牙槽骨缺损模型建立可以下调骨再生Lane-Sandhu评分、OPG、ALP、Collal的表达(P<0.05),上调NLRP3、caspase-1、IL-1β表达(P<0.05);BMMSC-Exos干预可以再次上调Lane-Sandhu评分及OPG、ALP、Collal蛋白表达(P<0.05),下调NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达(P<0.05).与模型组相比,BMMSC-Exos 及 MCC950干预后大鼠骨再生 Lane-Sandhu 评分、骨代谢关键蛋白(OPG、ALP、Collal)的表达提升(P<0.05);两者联合可进一步上调大鼠骨再生 Lane-Sandhu 评分及骨代谢关键蛋白表达(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞外泌体通过抑制 NLRP3 炎症小体活性来改善糖尿病牙槽骨缺损大鼠骨代谢,降低炎症反应,促进骨缺损的愈合.

背景:白细胞介素4可以提高骨替代材料的成骨效应,但其分子机制尚未明确,进一步阐明白细胞介素4提高成骨效应的作用机制,有助于为牙槽骨缺损患者的再生治疗找到安全、经济和有效的方法.目的:探讨白细胞介素4对巨噬细胞极化转化和骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其可能的作用机制.方法:M1组RAW264.7细胞用干扰素γ+脂多糖诱导24 h,白细胞介素4+M1组RAW264.7细胞用干扰素γ+脂多糖诱导24 h后加入白细胞介素4诱导24 h,白细胞介素4+AG+M1组RAW264.7细胞用干扰素γ+脂多糖诱导细胞24 h后加入白细胞介素4和JAK/STAT通路抑制剂AG-490诱导24 h.干预结束后,采用免疫荧光染色分析巨噬细胞表型标记蛋白诱导型一氧化氮合酶、CD206的表达;采用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平;采用RT-qPCR检测NLRP3、白细胞介素1β、caspase-1的 mRNA表达;采用 Western blot检测JAK1/p-JAK1、STAT6/p-STAT6、NLRP3、pro-IL-1β和pro-caspase-1通路蛋白的表达水平.随后将以上4组RAW264.7细胞与骨髓间充质干细胞transwell间接共培养24 h,然后进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,采用RT-qPCR检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的mRNA表达.结果与结论:①免疫荧光、ELISA检测结果显示白细胞介素4可促进M2样巨噬细胞CD206和白细胞介素10的表达,抑制诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α的表达;②RT-qPCR结果显示白细胞介素4可抑制NLRP3、白细胞介素1β、caspase-1 mRNA表达;③Western blot结果显示白细胞介素4可促进JAK1/p-JAK1、STAT6/p-STAT6和NLRP3蛋白表达明显增加;④与白细胞介素4+M1组RAW264.7细胞共培养的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色、茜素红染色明显增强,碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的mRNA表达明显升高.结果表明,白细胞介素4可能通过上调JAK1/STAT6通路,抑制NLRP3活化,从而促进巨噬细胞从M1向M2样极化转换,最终增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力.