目的:探讨富含丝氨酸/精氨酸剪接因子2（serine/arginine-rich splicing factor 2，SRSF2）对胶质母细胞瘤细胞铁死亡的影响及其可能的作用机制。方法:结合基因表达谱交互分析版本2（gene expression profiling interactive analysis 2，GEPIA2）与中国脑胶质瘤基因组图谱计划（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）在线数据库，对收集的天津医科大学总医院胶质母细胞瘤组织和非肿瘤脑组织病理切片进行免疫组织化学染色，分析SRSF2在胶质母细胞瘤组织中的表达情况及其与患者预后的关系；运用小干扰RNA（siRNA）技术靶向沉默胶质母细胞瘤细胞中的SRSF2基因，经蛋白免疫印迹（Western blot）和CCK8法检测其沉默SRSF2的效果及其对细胞增殖能力的影响；利用表达质粒pcDNA3.1（+）-SRSF2进行挽救实验；通过检测胶质母细胞瘤细胞中铁离子和丙二醛的水平，以及谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值变化研究铁死亡活性；牛津纳米孔技术（Oxford nanopore technologies，ONT）3代全长转录组测序分析SRSF2沉默后诱导的差异基因表达水平和差异选择性剪接（pre-mRNA alternative splicing，PMAS）变化。结果:与非肿瘤脑组织相比，SRSF2在胶质母细胞瘤组织中呈高表达，免疫组织化学结果阳性细胞率达88.48%±4.60%，远超非肿瘤脑组织中的9.97%±4.57%；高表达与患者总生存期和无病生存期呈负相关（ P<0.01）；经siRNA靶向沉默SRSF2的胶质母细胞瘤细胞增殖能力明显降低（ P<0.01），引入外源性SRSF2后增殖能力恢复；SRSF2 siRNA处理的胶质母细胞瘤细胞内铁离子和丙二醛水平升高（ P<0.05），谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值及谷胱甘肽途径中关键蛋白的表达均无明显变化（ P>0.05）；转录组测序结果显示SRSF2沉默后胶质母细胞瘤细胞中铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）发生显著的3′端PMAS改变。 结论:胶质母细胞瘤细胞中SRSF2抑制铁死亡、促进增殖可能是通过调控FSP1 PMAS实现的。

目的:探讨纳米孔测序技术（Oxford nanopore technologies，ONT）在假体周围感染（periprosthetic joint infection，PJI）病原菌确定中的应用价值。方法:收集2021年10月至2023年3月于西安市红会医院关节外科收治的符合美国骨骼肌肉感染协会（Musculoskeletal Infection Society，MSIS）2018年PJI诊断标准的患者32例（PJI组），男15例、女17例，年龄（63.93±8.93）岁；收集同期不符合2018年MSIS的PJI标准的翻修患者32例作为对照（非PJI组），男13例、女19例，年龄（65.53±8.54）岁。所有患者均在术前或术中穿刺抽取关节液，标本分别进行ONT、宏基因组二代测序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）检测及微生物培养检测。对两组绘制三种检测技术的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC），计算并比较灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及约登指数以评价不同检测方法在PJI中的检测效能。结果:32例PJI组中ONT阳性30例，共检出30种病原菌，检测时间为（22.37±8.36）h；mNGS阳性31例，共检出33种病原菌，检测时间为（46.25±9.36）h；微生物培养阳性17例，共检出8种病原菌，检测时间为（96.23±15.62）h。32例非PJI组中ONT、mNGS阳性分别为1和5例，分别检出1种和3种病原菌，微生物培养结果均为阴性。ONT与mNGS的检测时间及曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为（22.37±8.36）h、0.953[95% CI（0.901，1.006）]和（46.25±9.36）h、0.906[95% CI（0.835，0.977）]，均优于微生物培养的（96.23±15.62）h、0.766[95% CI（0.678，0.853）]，差异有统计学意义（ P<0.05）。ONT、mNGS、微生物培养的灵敏度分别为0.938、0.969、0.531，特异度分别为0.969、0.844、1.000，约登指数分别0.906、0.813、0.531。 结论:ONT检测在PJI诊断过程中较mNGS和微生物培养具有更高的诊断效能，在检出时间上也更有优势，也提示部分PJI并非单一微生物感染所致。

为深入挖掘甘青蒿功能基因和补充蒿属植物基因资源,采用基于三代牛津纳米孔测序技术(ONT)对甘青蒿叶片进行全长转录组测序,利用生物信息学手段对其进行分析.结果得到了15.66 Gb数据,18 634条非冗余全长转录本,并鉴定出4 358条新转录本.通过与数据库比对,2 184条新转录本及29 154个转录因子得到注释.分析萜类化合物生物合成途径,发现9个候选基因,其中hdr、MCS和CTI12_AA199400基因可能是甘青蒿萜类化合物生物合成的关键基因;ctcad3、CTI12_AA295060基因和部分转录因子可能参与甘青蒿的非生物胁迫抗性.本研究可为甘青蒿功能基因挖掘和生物资源利用提供数据基础.

近些年来DNA测序技术发展迅速,已经从第一代生化测序发展到第三代单分子测序.作为第三代测序技术中的一种不同于当前流行的其他测序技术,纳米孔测序技术是基于电信号的一种物理方法测序.许多研究者通常将高通量测序技术应用于食品微生物的研究,但是将纳米孔测序技术应用于食品中微生物的检测却鲜有报道.Oxford Nanopore Technologies(牛津纳米孔科技公司)研发的DNA测序仪MinION,是世界首例用于商业测序的纳米孔测序仪,经过不断完善,近年来MinION在DNA测序中被广泛应用.MinION测序一次需要的DNA量约1μg,其标准识别速度为一秒钟识别250个碱基,平均读长可至13kb～20kb,测序准确率可以达到98％.纳米孔测序的高识别速度和高准确率,完全满足快速检测的要求,将其应用于食品中微生物检测是完全可行的.

牛津纳米孔技术公司(ONT)的纳米孔测序仪(MinION)于2014年发布,代表了1种新型测序技术的诞生.该设备简单便携,可通过1台笔记本电脑在现场完成目标检测,它的特点是单分子测序、测序数据实时监控、超长读长和低成本等,目前已被应用于微生物种群鉴定、全基因组测序、新物种发现等方面.尽管该技术近几年取得了令人可喜的成绩,但同时也出现了一些问题和挑战,该文综述了MinION的技术特征及开发应用,并探讨了其发展前景.

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,导致的白垩病是严重影响养蜂生产的顽疾,每年给养蜂业造成较大损失.本研究旨在基于已获得的第三代长读段测序数据对球囊菌菌丝(Aam)和孢子(Aas)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行深入分析.[方法]利用Astalavista软件鉴定Aam和Aas中基因的AS事件类型.利用IGV浏览器对部分剪切异构体(isoform)的结构进行可视化.通过TAPIS pipeline对Aam和Aas中基因的APA位点进行鉴定.通过MEME软件对Aam和Aas中全长转录本的APA位点上游50 bp的序列特征进行分析并对motif进行鉴定.[结果]在Aam中共鉴定到286次AS事件,包括1 62次RI (Retained intron),87次A3 (Alternative 3'splice-site)、32次A5 (Alternative 5'splice-site)和5次SE (Skipping exon);在Aas中共鉴定到559次AS事件,包括305次RI、155次A3、85次A5、13次SE和1次MEE (Mutually exclusive exon).进一步分析发现,现有参考基因组上的多数注释基因结构并不完整;部分注释基因在菌丝和孢子中转录形成的isoform在数量和结构方面均存在差异;部分isoform在参考基因组中没有对应的注释基因.Aam中共鉴定到2748个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有1个APA位点的基因数量最多(726,26.42％);Aas中共鉴定到2768个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有5个以上APA位点的基因数量最多(1180,42.63％).部分基因在菌丝和孢子中含有不同的APA位点数.序列特征分析结果显示,球囊菌全长转录本的3'UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U和A分别富集在3'UTR的上游和下游.此外,在球囊菌全长转录本的APA位点上游鉴定到4个motif,分别是UCUCCU、UCUUCU、CCCACC和CCCCCU.[结论]本研究通过对球囊菌菌丝和孢子中基因的AS和APA进行深入分析,揭示了球囊菌转录组的复杂性,为完善现有的基因组和转录组注释提供了宝贵信息,也为探究AS和APA在球囊菌的基因表达调控中的作用提供了关键基础.

目的 评价牛津纳米孔测序技术(oxford nanopore technologies,ONT)在诊断复杂结构变异中的临床应用价值.方法 采集1例复杂结构变异的非梗阻性无精症患者外周血样本,以染色体G显带核型分析(karyotype analysis)与染色体微阵列分析(Chromosomal microarray analysis,CMA)为参考,进行纳米孔测序寻找致病原因,评价纳米孔测序对变异的检出能力.结果 在该患者的基因组中发现,CMA检测出4个缺失,5个重复,共计9个临床意义不明的染色体拷贝数变异(VOUS),3例纯合子状态区段(regions of homozygosity,ROH)以及15q15.3区段缺失,内含PPIP5K1、CKMT1B、STRC、CATSPER2基因;纳米孔测序共检测出6260个缺失、5624个插入、115个重复、22个倒位、32个易位,共计12053个结构变异,能够注释5559个结构变异影响2406个基因;纳米孔测序鉴定出平衡易位46,XY,t(1;3)(q22;q28)与染色体核型结果46,XY,t(1;3)(q21;q27)基本一致,在Chr1:156359988-156363186区域存在3198 bp缺失,该区域影响的基因有TSACC、RHBG和FGF12.结论 纳米孔测序技术可快速、高效、准确检测人外周血标本中染色体复杂结构变异和受影响的基因,可检测出传统检测方法无法检出的缺失片段,是常规方法的补充,具有重要的临床应用价值.

目的 分析咽拭子中存在多种少量的机会致病性微生物(即病原体本底),为测序数据提供初步分析结果.方法 利用牛津纳米孔测序技术(oxford nanopore technologies)对 12个健康人的咽拭子样本进行测序并分析微生物序列.结果 咽拭子样本中主要是常见的宿主共生菌群,具体为拟杆菌门(29.000％～55.000％)、变形菌门(12.000％～24.000％)、厚壁菌门(4.000％～7.000％)、梭杆菌门(2.000％～3.000％)和放线菌门(0.300％-1.000％)等.在拟杆菌门中,普雷沃菌(82.000％～93.000％)、黄杆菌(2.000％～9.000％);变形菌门中,γ-变形菌(61.000％～79.000％)、β-变形菌(5.000％～28.000％);厚壁菌门中,链球菌(35.000％～61.000％)、葡萄球菌(2.000％～7.000％)、韦荣球菌(17.000％～33.000％)、梭菌(2.000％～5.000％)、微单胞菌(0.6000％～1.000％);梭杆菌门中,梭杆菌(54.000％～84.000％)、纤毛菌(9.000％～25.000％);放线菌门中,放线菌(19.000％～47.000％).最后,还在样本中检测出了少量的病毒,鉴定结果显示这些病毒主要是寄生在口腔中的细菌噬菌体.结论 研究为临床宏基因组测序技术在呼吸道样本中病原体分析奠定了基础.

相较于目前普遍应用的二代测序(NGS)技术,长读长测序(LRS)技术是一种能够连续读取数百万个碱基对的测序技术.本文回顾了单分子实时测序技术、牛津纳米孔测序技术和新型单分子LRS技术在肿瘤领域的研究应用.LRS技术能够更精确地检测肿瘤基因组变异,包括结构变异、拷贝数变化、基因融合等.除基因组变异检测外,LRS技术还为描绘转录组图谱、表观遗传修饰图谱提供了有效手段.LRS技术可以有效弥补NGS技术的部分技术瓶颈,深入揭示生物大分子在健康和疾病状态下的复杂性状,为更好地理解肿瘤的发生与发展机制、制定治疗策略和开发药物提供新的理论基础.此外,本文还展望了LRS技术在肿瘤领域临床应用中的潜在价值.