目的:构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)和核因子 κB1(nuclear factor kappa B1, NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK)，对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus, Flu)的增殖特性进行初步鉴定。 方法:采用CRISPR/Cas9技术，将MDCK细胞的 MAVS和 NFκB1基因敲除，获得稳定的敲除细胞系。接种Flu并检测培养上清中病毒的血凝(hemagglutinination, HA)滴度和TCID 50滴度，与野生MDCK细胞进行比较。 结果:获得2株稳定敲除的MDCK细胞系MDCK- MAVS－和MDCK- NFκB1 －，与野生MDCK细胞同样为贴壁的上皮样细胞。接种Flu后，2株敲除细胞系测定的病毒HA滴度与野生细胞相比无明显差异，TCID 50分别比野生MDCK细胞系提高了9.5倍和10倍，其差异有统计学意义( P＝0.0316)。 结论:本研究构建的2株基因敲除细胞系MDCK- MAVS－和MDCK- NFκB1 －能够提高Flu的感染力，为Flu的分离培养提供了新的候选细胞系。

背景:体内组织器官的发生是一个精确而自主调控的过程,生物力学因素在该宏观尺度上的功能是值得探索的基础科学问题.目的:探讨细胞力学作用对3D Madin-Darby犬肾(MDCK)上皮微组织形态发生的影响.方法:利用荧光共振能量转移技术观测MDCK上皮微组织的形成,检验不同的细胞力学信号和胞外基质环境对微组织发生的影响以及相应的ERK活性变化.结果与结论:①抑制ERK信号通路对MDCK上皮微组织的生长有抑制作用;②抑制细胞收缩力信号如ROCK通路和肌球蛋白Myosin Ⅱ活性,ERK活性降低,微组织变小;③选择性地抑制质膜和内质网上的钙离子通道导致ERK活性和微组织生长受到抑制;④通过抑制细胞膜上力学敏感受体Piezo离子通道或整合素信号,分别导致微组织变小或不能有效生成组织形态;⑤不同的细胞外基质组分影响微组织的形态发生,Matrigel胶中添加Ⅰ型胶原使微组织从微球形向长体形转变;⑥该研究结果初步显示细胞和细胞外基质环境中的机械力学信号在MDCK上皮微组织发生中具有重要作用,并提供了部分的分子机制理解.

目的 了解西安市流感病毒的分型和流行特征.方法 收集2009年8月至2017年12月西安市5家流感监测哨点医院的流感样病例咽拭子标本21 856份,采用实时荧光定量PCR法进行流感病毒核酸检测和分型,采用鸡胚细胞(或)犬肾传代细胞系( MDCK)分离病毒,同时将流感样病例分为7个年龄组.采用SPSS 18.0软件分析流感病毒监测结果和数据.结果 21 856份流感样病例中,流感病毒阳性标本数为3 539份,阳性率为16.19%,其中A型流感病毒(包括季H1型、季H3型、新甲H1型、H7型)占62.39%(2 208/3 539),B型流感病毒(Victoria、Yamagata 和B型未分型)占37.50%(1 327/3 539),混合型为0.11%(4/3 539).不同年份流感病毒阳性检出率差异具有统计学意义(χ2＝357.65,P＜0.01). 1至3月A型主要流感病毒占49.07%(947/1 930)、B型占50.93%(983/1 930),10至12月A型流感病毒占78.07%(1 061/1 359),B型占21.93%(298/1 359). 1至3月和10至12月A型主要流感病毒和B型流感病毒构成比差异具有统计学意义( χ2＝550.06,P＜0.05). 0～3岁,＞3～7岁,＞7～13岁,＞13～18岁,＞18～24岁,＞24～60岁和＞60岁年龄组流感病毒检出阳性率分别为12.61%、19.41%、19.66%、22.98%、14.91%、13.50%和12.84%,差异具有统计学意义(χ2＝202.52,P＜0.05).结论 西安市流感病毒以A型为主,冬春季为流感病毒高发季节.人群普遍易感,推荐接种流感疫苗.

人用狂犬病疫苗生产经历了神经组织、禽胚及细胞培养3个发展阶段[1-2].随着生物技术发展,不同时期生产企业采用不同细胞、工艺进行生产,制品的质量不断提升.目前,国内已上市人用狂犬病疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系(primary cell lines,PCLs)、传代细胞系(continuous cell lines,CCLs)及二倍体细胞系(diploid cell lines,DCLs),代表性的细胞基质分别为原代地鼠肾细胞、Vero细胞和MRC-5细胞,其中以采用Vero细胞生物反应器发酵生产为主.连续传代细胞残余DNA的质量控制一直都是关注的热点.本文对国内不同生产方式制备的狂犬病疫苗特点、未来发展方向及人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留控制相关问题进行探讨,以期对人用狂犬病疫苗生产、研发及产品质量提升提供借鉴.

目的 探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响.方法 以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系.运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-time PCR等技术进行IFNAR1功能验证.结果 随着PRV感染时间延长,敲除IFNAR1基因可以显著促进PRV-TK mRNA的转录,PRV-gE蛋白的翻译以及子代病毒的毒力.结论 IFNAR1在抑制PRV增殖中发挥重要作用.

目的 分析犬肾细胞系(MDCK)感染犬腺病毒1型(CAV-1)后各种干扰素(IFN)亚型及其受体分子转录水平的表达情况.方法 建立犬IFN-β、IFN-β受体(IFNAR1)、IFN-λ1、IFN-λ1受体(IFN-λ1R)、IFN-λ3和IFN-λ3受体(IFN-λ3R)的染料法定量PCR方法,分析了MDCK在Poly Ⅰ∶C处理和接种CAV-1后细胞内各IFN及受体分子转录水平的相对含量.结果 正常MDCK细胞内存在较高含量的IFN-λ3R且含量显著高于其他IFN及受体分子的转录水平;用Poly Ⅰ∶C处理MDCK细胞24 h后,IFN-λ1R、IFN-λ3和IFN-λ3R的表达量均显著性上调,而IFN-β、IFN-λ1和IFNAR1几乎没变化;接种CAV-1后,IFN-α的含量急剧上升至6倍.结论 MDCK细胞存在不同水平浓度的IFN分子及其受体转录产物,且在Poly Ⅰ∶C刺激和腺病毒感染时受体分子的表达谱不同.

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type Ⅰ interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度.结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1-/细胞活力无影响(P＞0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P＜0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P＜0.05,TK:P＜0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1-/的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P＜0.05,TK:P＜0.05);WesternBlot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1-/-的表达显著低于PK15细胞(P＜0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖.以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制.