研究国内相关文献,概述汉防己甲素在抑制严重急性呼吸系统综合征冠状病毒Ⅱ型、猪流行性腹泻病毒、登革热病毒等方面的作用,以及其在风湿免疫系统、呼吸系统、神经系统、消化系统等疾病中的抗炎作用等.总结发现,汉防己甲素可以作为双孔通道拮抗剂抑制病毒进入和抑制病毒复制发挥抗病毒作用,还可以通过调控核转录因子蛋白家族(NF-κB)、Janus激酶信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)、环氧化酶-2/前列腺素E2(COX-2/PGE2)、Nod样受体蛋白3(NLRP3)等相关信号通路调控炎症因子产生,调节机体抗病毒免疫,从而发挥抗炎和抗病毒的作用.重点分析了汉防己甲素对冠状病毒、埃博拉病毒等多种病毒的干预作用及机制,以及其发挥抗炎作用所涉及到的机制,旨在为今后对汉防己甲素进行深入的药用研究与应用提供参考.参考文献70篇.

目前,动物疫苗佐剂主要以铝佐剂和油乳佐剂为主,存在免疫效果差、副作用明显等问题,亟须安全有效的新型佐剂替代.随着纳米颗粒在佐剂应用领域研究的深入,其良好的免疫增强作用、生物相容性、纳米尺寸效应、抗原负载能力、抗原缓释效应和组织靶向性等优势引起了研究人员的极大关注,有望作为新型动物疫苗佐剂用于动物疾病防治.迄今为止,针对如猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪流行性腹泻、非洲猪瘟、牛病毒性腹泻、口蹄疫、禽流感和新城疫等重要动物传染病纳米疫苗的研究取得了重大进展.综述总结了国内外动物疫苗纳米颗粒佐剂的应用及作用机制,分析了影响纳米颗粒佐剂免疫增强效果的理化因素,以期为新型动物疫苗佐剂研制及开发提供参考.

[背景]猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展.猪感染这 3 种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失.[目的]建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和 SVA 单一或混合感染的三重 RT-PCR 检测方法.[方法]参考 GenBank 中登录的 PDCoV 和SADS-CoV N基因、SVA L/P1 基因保守区域序列设计 3 对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒 PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV 和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量;以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等 6 种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重 RT-PCR 法的特异性;以批间和批内试验验证其重复性;经检测临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果.[结果]建立的三重RT-PCR检测方法最佳退火温度为 58.3℃,引物最佳浓度分别为 0.50、0.25和 0.25 μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为 1、1 和 10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内试验检测结果均一致.最后经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV 和 SVA 的阳性率分别为 4.4%、0%和 0.73%,与已报道的检测方法一致.[结论]建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3 种病毒提供了技术支撑.

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)导致仔猪和育肥猪发生急性肠道传染病,是危害养猪业最重要的病原体之一.目前发现PEDV能够编码至少16个非结构蛋白,其中nsp9能够结合至单链RNA中,但是其功能机制还不清楚.本研究通过免疫沉淀联合蛋白质谱分析,筛选出潜在的与PEDV nsp9宿主互作蛋白.通过进一步免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)和激光共聚焦技术确认了nsp9 与热休克蛋白HSPA8、Toll相互作用蛋白Tollip、热休克蛋白HSPA9、线粒体外膜蛋白TOMM70互作.其中,过表达HSPA8使nsp9的表达量先上调而后下调,并促进PEDV的增殖;过表达Tollip使nsp9 的表达量显著上调,并抑制PEDV的增殖;过表达TOMM70 使nsp9 的表达量显著下调,但对PEDV的增殖无明显影响;过表达HSPA9 对nsp9 的表达以及PEDV的增殖均无明显影响.该研究为探索nsp9互作蛋白在PEDV感染过程中的功能提供了重要信息.

目的 建立一种快速检测猪戊型肝炎病毒(HEV)的方法.方法 针对HEVORF2基因保守序列设计1对引物,基于SYBR GreenⅡ染料,建立了检测HEV的实时荧光定量RT-PCR方法.结果 该方法只能对猪戊型肝炎病毒检测到荧光,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒均不能检测到荧光信号,特异性好;检测HEV时,在4.10×102～4.10×108拷贝/μL内具有良好的线性关系,灵敏度可以达到1.00×102拷贝/μL,扩增相关系数为0.996,扩增产物的熔解温度为84.0℃±0.1℃,该检测方法组内变异系数为0.83％～0.94％,组间变异系数为0.83％～0.94％,重复性较好.利用该方法对临床61份来自四川各地的猪肠内容物进行检测,检出9份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100％.结论 建立的针对HEV的荧光定量RT-PCR有效可行,对HEV的临床检测和进一步研究奠定了基础.

目的:探索猪流性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N蛋白)对 Ⅲ 型 λ 干扰素(IFN-λ)的影响.创新点:首次在IPEC-J2细胞模型中证明PEDV流行病毒株的N蛋白可拮抗由聚肌胞苷酸(poly(I:C))诱导表达的 Ⅲ 型IFN,但不能拮抗 Ⅰ 型或 Ⅱ 型IFN.这种拮抗作用是通过阻断核因子 κB(NF-κB)入核来实现的.方法:利用poly(I:C)刺激IPEC-J2细胞使其IFN诱导表达.实验组转染N蛋白真核表达载体,对照组转染空载体;利用定量聚合酶链反应(qPCR)、荧光素酶报告基因等技术,检测N蛋白对 Ⅰ 型、Ⅱ型及 Ⅲ 型IFN表达抑制情况.利用间接免疫荧光技术,检测NF-κB在细胞内的分布情况,分析NF-κB入核与N蛋白抑制IFN-λ 表达的关系.结论:2013年至2017年间从浙江省不同的农场分离的10个PEDV毒株的N蛋白具有较高的核苷酸同源性,而疫苗毒株CV777的N蛋白在系统发育树中形成单系分支(图1).流行病毒株的N蛋白可以在IPEC-J2细胞中成功表达(图2和3),并拮抗由poly(I:C)诱导表达的 Ⅲ 型IFN,但不能拮抗 Ⅰ 型或 Ⅱ 型IFN(图4和5).PEDV N蛋白通过阻断NF-KB入核来对poly(I:C)诱导的IFN-λ3产生的抑制作用(图6).

[背景]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪而引起的一种急性肠道传染病,常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水.自2010年起,其大规模的暴发给养猪业造成巨大的经济损失.由于对PEDV免疫机理及侵入机制知之甚少,至今仍缺乏有效的PED防治措施.[目的]研究orf3对PEDV体外增殖的影响.[方法]利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作技术拯救一系列携带不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV;将获得的重组PEDV以MOI 0.1感染Vero细胞,分别于感染的第8、16、24、32、40、48 h测定其TCID50并绘制病毒生长曲线;分别在感染25 h和36 h利用全自动细胞计数分析仪对6孔板内的细胞进行计数,并于感染后的第12、24、36、48 h用CCK-8试剂盒对其细胞活力进行测定.[结果]RT-PCR结果及细胞病变观察证明成功拯救到了携带不同orf3基因或orf3基因缺失的重组PEDV;进一步的免疫组化分析结果证实PEDV的ORF3蛋白可以在Vero细胞中合成.SPSS软件分析表明携带orf3基因的重组PEDV的滴度(TCID50)显著高于缺失orf3基因的重组PEDV的滴度;带有orf3基因的重组PEDV感染Vero细胞25 h和36h时的活细胞数显著高于缺失orf3基因的重组病毒感染相同时间时的活细胞数;而且重组PEDV感染Vero细胞24 h后,带有orf3基因的重组PEDV的细胞活性显著高于缺失orf3基因的重组病毒.[结论]ORF3蛋白对于PEDV在Vero细胞中的增殖具有促进作用,该作用是通过延缓或减少感染细胞的死亡实现的.本研究为揭示PEDV orf3基因的功能和PEDV复制机制的研究提供理论基础.

猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 是一种肠道α冠状病毒, 靶向猪小肠上皮细胞, 使得小肠上皮组织被破坏, 肠道充血, 肿胀, 引起猪群水样腹泻, 导致育肥猪厌食和体型消瘦.其中哺乳仔猪死亡率高.2010年后, 随着新的PEDV变异毒株出现, PED再一次在全球暴发, 特别是亚洲国家, 造成了严重的经济损失.机体的先天免疫并不能完全抵抗PEDV对机体的侵害, 因此了解PEDV通过影响干扰素 (Interferon, IFN) 的产生来逃逸先天性免疫的途径十分必要, 同时也为治疗PEDV感染以及研发PEDV疫苗提供了思路.

PEDV N蛋白为高度保守性蛋白,具有极强的免疫原性,因此在临床诊断中具有重要作用.本文对实验室前期制备的针对N蛋白的单克隆抗体9 G11的抗原表位进行精确定位.通过与N蛋白进行免疫印迹反应证明9G11所识别的表位是N蛋白的线性表位.利用NEB十二随机肽库进一步定位9G11核心表位氨基酸,结果显示位于N蛋白75～78位的氨基酸FYYL为9G11所识别的关键氨基酸.对20株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明此表位高度保守.确定该抗体识别的抗原表位有助于了解N蛋白的结构与功能,同时也为以表位为基础的快速、准确并具临床应用价值的PEDV诊断方法的建立打下良好基础.

旨在建立能同时检测出猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪丁型冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)的二重RT-PCR检测方法.根据GenBank已收录发表的PEDV和PDCoV基因序列设计2对特异性引物,首先运用RT-PCR反应技术,通过PEDV和PDC0V病毒的目的基因的单项扩增,对反应条件进行优化.然后通过特异性试验、敏感性试验以及临床样品的检测验证确定二重RT-PCR方法的建立.结果显示,目的基因PEDV-M扩增的片段大小是750 bp,PDCoV-N扩增的片段大小是372 bp;能够同时检测出PEDV和PDCoV目的基因,却检测不到PRV、CSFV、PPV三种病毒;体系优化扩增PEDV-PDCoV混合核酸浓度下限为100 pg/μL;能够初步诊断出临床疑似病毒感染的病例.结果表明,成功的建立PEDV-PDCoV二重RT-PCR检测方法,此方法敏感性高、特异性强,是一种能够快速有效的检测出猪PEDV-PDCoV单病毒感染或多病毒混合感染的临床诊断方法.