目的 探究实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)合并急性感染时免疫细胞的改变及其功能特征.方法 利用大鼠乙酰胆碱受体(AChR)α亚基的 97-116(R97-116)肽段免疫 6～8 周龄雌性Lewis大鼠,发病高峰期腹腔注射脂多糖(LPS)诱导急性感染模型为LPS组,腹腔注射PBS作为对照(PBS组).记录临床评分及体质量.流式细胞术检测外周循环和淋巴器官中Th1、Th17、Treg细胞的比例以及脾脏滤泡辅助T细胞(Tfh)、树突状细胞(DC)、生发中心B细胞(GCB)的比例和功能.对脾脏分别进行PNA及CD4、Foxp3 免疫荧光检测.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清抗R97-116 IgG抗体及亚型水平.结果 与PBS组相比,LPS组大鼠临床症状较重、体质量减轻,脾脏Treg细胞(CD4+CD25+)比例(P=0.016)及Foxp3 的表达均明显减少.另外,LPS组大鼠脾脏PNA的表达增多且呈簇状,且GCB细胞表达MHC-Ⅱ及分泌IL-6 的比例明显增加(P=0.002、P=0.017).LPS组大鼠DC亚群表达CD80 的平均荧光素强度(MFI)增加,但无统计学差异(P=0.057).LPS组大鼠外周血免疫球蛋白G(IgG)水平无变化,保护性抗体IgG1 水平降低(P=0.005),致病性抗体IgG2b水平无变化,IgG1/IgG2b下调(P=0.018).结论 LPS可能通过减少脾脏Treg细胞的比例及Foxp3 的表达,增强脾脏生发中心反应、GCB细胞的功能以及DC亚群共刺激的能力来下调保护性抗体水平,最终导致EAMG大鼠的临床症状加重.

目的:检测生发肽的致突变作用,探讨生发肽的遗传毒性.方法:通过Ames实验,中国仓鼠肺成纤维细胞染色体畸变实验以及小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验,评价生发肽的遗传毒性.结果:在Ames实验中,S9代谢和非代谢活化条件下,生发肽浓度为每皿≤5 000 μg,对所测5种菌株回复突变菌落数均未出现剂量依赖性增加;在染色体畸变实验中,S9代谢和非代谢活化条件下,药物浓度为165,330和660μg· mL-1时,细胞染色体畸变率与溶剂对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05),且无剂量—反应关系;在小鼠骨髓细胞微核实验中,在250,500和1 000 mg· kg-3个剂量组中均未见骨髓中含微核的嗜多染红细胞数增加.结论:在实验剂量范围内,生发肽遗传毒性结果为阴性.

高度炎性增生性脓皮病曾以“芽生菌病样脓皮病”、“增殖性脓皮病”或“霉菌病样脓皮病”等名称报告。这种现象在营养不良或服卤素药物的病人和文身或有异物的部位常见,常有葡萄球菌和链球菌。活跃的急性炎性反应,从多形核白细胞中释放出结缔组织激活肽。这些肽刺激基质形成和纤维母细胞增生,纤维母细胞的增生使损害增大并延长真皮乳头,延长的真皮乳头支持生发细胞,产生假上皮瘤样增生。

目的 克隆、表达细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶(EgPGAM),分析其免疫反应性及其在原头节、包囊及成虫中的分布情况,对EgPGAM的诊断价值进行初步评价. 方法 提取细粒棘球蚴原头节RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增EgPGAM基因,测序.通过多种生物信息学软件分析EgPGAM的理化性质、保守结构域、抗原表位和同源性等.利用Mega 5.0软件进行序列特征分析,采用邻接法构建系统进化树.将EgPGAM基因连接至pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3)中进行诱导表达,镍柱纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达情况并进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析.免疫荧光定位分析EgPGAM在原头节、包囊及成虫中的分布.采用ELISA评价EgPGAM的诊断价值. 结果 EgPGAM长756 bp,共编码251个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量(Mr)约28 000,等电点为8.29,不含信号肽,无跨膜区.EgPGAM含有12个高保守的氨基酸位点、3个保守的催化活性位点、1个底物结合位点和7个B抗原表位.EgPGAM的氨基酸序列与多房棘球绦虫、猪带绦虫、华支睾吸虫、秀丽隐杆线虫、人和羊的PGAM序列相似性分别为99％、94％、78％、45％、57％和4％.SDS-PAGE分析结果显示,EgPGAM在E.coli BL21 (DE3)中大量表达,主要以可溶形式存在;Western blotting分析结果显示,EgPGAM可与感染细粒棘球蚴的绵羊血清发生反应.免疫荧光定位显示,EgPGAM主要分布在原头节表皮层和顶突沟,包囊生发层和成虫薄壁组织.建立的间接ELISA敏感性为55.6％ (15/27),特异性为86.4％ (89/103). 结论 EgPGAM广泛分布于细粒棘球蚴和细粒棘球绦虫中,具有较好免疫反应性,但敏感性较低,不适合作为细粒棘球蚴病的候选诊断抗原.

目的 研制细粒棘球绦虫水通道蛋白9(EgAQP9)的特异性多肽抗体,并用于检测其在棘球蚴囊壁、生发细胞及原头蚴中的组织分布情况.方法 根据EgAQP9 特异氨基酸序列设计合成B细胞抗原多肽,再用合成的多肽偶联KLH 作为免疫原注射免疫新西兰兔以制备多克隆抗体.酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测多肽抗体滴度,蛋白免疫印迹法(West-ern blot)测定多肽抗体免疫活性,免疫荧光实验分析EgAQP9 的亚细胞定位,免疫组化实验分析EgAQP9 组织定位.结果 免疫新西兰兔成功制备出多肽抗体;间接ELISA检测其多肽抗体效价高达1:256 000;Western blot 结果显示多肽抗体能够特异识别细粒棘球绦虫中36 kDa处的条带,与EgAQP9 预测的相对分子量大小相符;免疫荧光实验结果显示EgAQP9 分布于棘球蚴生发细胞的胞质、胞膜中;免疫组化实验显示该蛋白主要分布在原头蚴表面及棘球蚴囊泡生发层.结论 本研究以制备的EgAQP9 兔源多克隆抗体定位了 AQP9 在棘球蚴生发细胞、原头蚴及棘球蚴囊壁中的分布状况.

目的 通过观察泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)点突变蛋白与野生型蛋白过量对小鼠卵母细胞成熟的影响,并分析其在小鼠卵母细胞离体成熟过程中的作用及作用方式.方法 通过原核重组蛋白技术制备UCHL1点突变(C90S和I93M)和野生型蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,通过显微注射技术将UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白、UCHL1点突变蛋白与GST的融合蛋白、GST、PBS分别注射到小鼠未成熟卵母细胞,或在体外培养基中添加UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白,分析野生型UCHL1过量、UCHL1(I93M)点突变蛋白添加及泛素水解酶活性缺失的UCHL1(C90S)点突变蛋白添加对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率的影响.分离UCHL1(I93M)点突变小鼠与野生型小鼠的生发泡期卵母细胞,体外培养3 h后比较其GVBD率.结果 显微注射UCHL1野生型蛋白及其点突变体与GST的融合蛋白的各组之间、注射GST组、注射PBS组卵母细胞GVBD率差异均无统计学意义,在培养基中添加UCHL1蛋白与GST的融合蛋白组卵母细胞GVBD率与无注射无添加对照组相比差异也无统计学意义(P均>0.05).注射UCHL1(C90S)与GST的融合蛋白组有少量生发泡期卵母细胞体外发育为MⅡ期卵母细胞后呈现极体较对照组偏大的现象.UCHL1(I93M)点突变小鼠生发泡期卵母细胞体外GVBD率与野生型小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 在小鼠卵母细胞中添加外源性UCHL1、有致病作用的UCHL1(I93M)突变体或泛素水解酶活性丧失的UCHL1(C90S)突变体均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程,UCHL1(I93M)点突变小鼠卵母细胞GVBD率亦无异常,但UCHL1(C90S)点突变可能影响极体的形成.

目的 探讨不同浓度的二甲双胍对体外培养的多房棘球蚴囊泡及原头节自噬及凋亡的影响.方法 将体外培养的多房棘球蚴囊泡及原头节与1、5、10 mmol/L的二甲双胍分别共培养24、48 h,以PBS为对照,显微镜下观察囊泡的活性、大小及透明度,使用伊红染色观察原头节的活性,并计算成活率;1、5、10 mmol/L的二甲双胍与多房棘球蚴原头节共培养48 h时,利用试剂盒测定原头节中与细胞凋亡相关的半胱氨酸肽酶3(caspase3)、caspase9酶活性;收集囊泡中的生发层细胞,使用流式细胞术检测其凋亡情况;提取囊泡及原头节蛋白,使用蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析与细胞凋亡相关的剪切-caspase3(cleaved-caspase3)、caspase9、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)的相对表达量;1、5、10 mmol/L的二甲双胍与多房棘球蚴囊泡及原头节共培养48 h时,Western blotting分析二甲双胍对囊泡及原头节中磷酸化一磷酸腺苷(AMP)依赖的蛋白激酶(P-AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),自噬相关基因14(Atg14)、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的变化.两组间差异的比较采用t检验,多组间差异的比较采用方差分析.结果 1、5、10 mmol/L的二甲双胍与多房棘球蚴囊泡共培养后,随着培养时间的延长囊泡活性逐渐下降,囊泡内结构紊乱,浑浊度增加;与10 mmol/L二甲双胍共培养48 h时,可见囊泡中形成类似于凋亡小体样结构.不同浓度二甲双胍与多房棘球蚴原头节共培养24 h时,1、5、10 mmol/L组原头节存活率分别为(0.91±0.10)％、(0.8±0.12)％、(0.57±0.11)％,低于对照组(0.99±0.02)％(F=95.829,P<0.05);共培养48 h后,1、5、10 mmol/L原头节存活率分别为(0.68±0.18)％、(0.46±0.15)％、(0.04±0.01)％,低于对照组(0.80±0.22)％(F=287.524,P<0.05).与10 mmol/L二甲双胍共培养至48 h时,所有原头节均出现红染;共培养48 h时,1、5、10 mmol/L组中原头节caspase3相对表达量分别为33.32±2.94、53.89±1.01、124.88±26.44,高于对照组(16.21±6.20)(F=36.628.452,P<0.05);caspase9相对表达量分别为47.48±9.56、54.50±1.29、165.09±16.85,高于对照组(25.295±3.560)(F=120.612,P<0.05).共培养48 h后,1、5、10 mmol/L组囊泡生发层细胞的凋亡率分别为(14.94±1.35)％、(23.85±2.97)％、(33.87±4.93)％,高于对照组(8.92±1.95)％(F=293.45,P<0.05),1、5、10 mmol/L组cleaved-caspase3、caspase9的相对表达量均高于对照组(F=144.574、45.675,P<0.05),Bcl-2的相对表达量低于对照组(F=16.642,P<0.05).不同浓度二甲双胍与原头节共培养48 h后,1、5、10 mmol/L组中cleaved-caspase3、caspase9的相对表达量均高于对照组(F=36.044、19.950,P<0.05);Bcl-2的相对表达量均低于对照组(F=39.487,P<0.05).不同浓度二甲双胍与囊泡共培养48 h后,1、5、10 mmol/L组P-AMPK、mTOR的相对表达量均高于对照组(F=33.342、60.617,P<0.05),自噬相关蛋白Atg14、LC3-Ⅱ的相对表达量均低于对照组(F=41.688、41.375,P<0.05).不同浓度二甲双胍与原头节共培养48 h后,P-AMPK、mTOR、Atg14、LC3-Ⅱ的相对表达量均高于对照组(F=25.853、10.695、12.528、17.613,P<0.05).结论 二甲双胍在体外可抑制多房棘球蚴囊泡及原头节的活性并促进其凋亡,呈现浓度依赖性及时间依赖性,通过AMPK-mTOR信号通路启动自噬以发挥作用.

目的 用生物信息工具分析细粒棘球绦虫表面抗原热休克蛋白70(EgHSP70)的理化性质、结构域等信息,并制备多克隆抗体进行人、羊、小鼠肝包虫病的免疫组化研究.方法 EgHSP70氨基酸序列经NCBI数据库中下载,用ProtParam(性质)、SignalP-5(信号肽)、SOSUI(亚细胞定位)、ProtScale、SOSUI、DNAST AR(亲疏水性)、SOMPA(二级结构)、Swissmod-el(三级结构)、TMHMM(跨膜区域)工具分析.制备多克隆蛋白抗体,分别进行人、绵羊、C57BL/6J小鼠肝包虫的免疫组化染色.结果 EgHSP70是由258个氨基酸序列组成,分子式为C1248H2024N354O392S2,不稳定指数为42.00,为亲水蛋白,无信号肽,无跨膜区,且定位于细胞质中.二级结构中,a螺旋占47.29％,β折叠占16.28％,β转角占8.53％,无规则卷曲占27.91％.免疫组化结果显示,EgHSP70多克隆抗体能够在细粒棘球绦虫的生发层(包囊)细胞中高表达,在羊、C57小鼠正常肝组织中少量表达,在人肝脏组织中不表达.结论 免疫组化检测EgHSP70的多克隆抗体在不同的物种组织中,能识别生发层细胞及细粒棘球蚴虫体细胞.