目的 观察华蟾酥毒基(CBF)对肝癌细胞增殖的抑制作用,采用转录组学测序技术揭示相关基因及信号通路,探讨CBF抗肝细胞癌(HCC)的可能作用机制.方法 用不同浓度的CBF(0、2、4、8、16和32 μmol·L-1)处理人HCC细胞SMMC-7721和JHH7,时间梯度为24、48和72 h,WST-1试剂盒检测细胞增殖情况.根据WST-1试剂盒检测结果,用CBF 2 μmol·L-1干预SMMC-7721和JHH7细胞24 h,然后进行转录组学基因表达测序分析差异表达基因,并行生物信息学分析.基于文献报道及TCGA数据库观察部分差异表达基因在HCC组织中的表达情况,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测并验证CBF靶基因的表达情况.结果 ①CBF对SMMC-7721和JHH7细胞具有抑制增殖作用,且呈浓度-时间依赖性.②转录组学测序结果显示,经CBF干预后,SMMC-7721细胞获得差异表达基因共计578个(其中上调基因309个、下调基因269个),JHH7细胞获得差异表达基因共计611个(其中上调基因349个、下调基因262个),两组细胞获得的交集基因共有106个(差异倍数>2,P<0.05).③生物信息学分析显示,激活转录因子3(ATF3)、羰基还原酶1(CBR1)、细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)、生长停滞和DNA损伤可诱导蛋白β(GADD45B)、钾二孔域通道亚科K成员5(KCNK5)、起源识别复合亚基5(ORC5)基因的转录水平在HCC组织中呈异常表达并与患者预后相关.④RT-qPCR结果显示,CBF能促进ATF3、KCNK5和GADD45B基因的表达,抑制CBR1、CKAP4和ORC5基因的表达,与测序结果一致.结论 CBF具有抑制HCC细胞增殖的作用,其机制可能与调控ATF3、KCNK5、GADD45B、CBR1、CKAP4和ORC5基因表达有关.

目的:检测生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45g (growth arrest and DNA damage inducible protein 45g,GADD45g)基因在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓标本和细胞系中的表达情况及其表达水平与AML患者预后的关系,探究过表达GADD45g对AML细胞增殖、凋亡、衰老、周期、分化和药物敏感性的影响.方法:选取中国医学科学院血液病医院2013年1月至2016年12月初次诊断为AML患者的骨髓标本共27例,用Real-time PCR和Western blotting检测AML患者、正常对照骨髓单个核细胞以及AML细胞系中GADD45g mRNA和蛋白水平的表达情况.在两个相互独立的数据集GSE10358和GSE425-GPL317中分析GADD45g表达与AML患者的总生存率(overall survival,OS)和无事件生存率(event-free survival,EFS)的相关性.构建GADD45g过表达慢病毒并感染AML细胞系U937、THP-1和Molm-13,通过生长曲线、集落形成、β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术分析Annexin V/7AAD染色和PI染色等方法分析GADD45g过表达对AML细胞增殖、克隆形成、衰老、凋亡、周期、分化和化疗药物敏感性的影响.结果:GADD45g在AML患者和AML细胞系中的表达水平显著低于正常对照(均P＜0.01).低表达GADD45g的AML患者的OS (P＜0.05)和EFS较高表达患者显著缩短(均P＜0.05).在AML细胞系中过表达GADD45g能显著抑制细胞增殖、集落形成,显著促进细胞的凋亡、衰老、周期阻滞和分化,增强了细胞对化疗药物敏感性(P＜0.05或P＜0.01).结论:GADD45g基因在AML患者骨髓组织和AML细胞系中低表达,对AML细胞系有显著的全方位的抑制作用,其表达水平对AML具有预后判断价值.

目的:研究生长抑制和DNA损伤诱导基因45β(GADD45B)在足细胞损伤中的作用及机制. 方法:微分离37例肾活检证实的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者肾小球,qRT-PCR检测肾小球GADD45B基因表达,同时进行免疫组化检测GADD45B蛋白表达.进一步利用模式动物斑马鱼研究GADD45B基因功能,Podocin启动子驱动和UAS/GAL4系统构建足细胞上特异性表达GADD45B转基因斑马鱼,硝基还原酶/甲硝唑(NTR/MTZ)系统特异性诱导足细胞损伤,观察斑马鱼水肿发生率,定量检测蛋白尿及足细胞凋亡. 结果:FSGS患者肾小球GADD45B基因和蛋白表达水平显著高于正常对照组,并与FSGS患者白尿、血白蛋白及血肌酐水平密切相关;斑马鱼研究结果显示,足细胞上高表达GADD45B能够显著加重MTZ诱导的足细胞损伤,GADD45Ba/b转基因鱼的水肿发生率和蛋白尿水平均显著高于野生型斑马鱼.活性caspase染色结果显示,GADD45B转基因鱼发生凋亡的足细胞数显著高于非转基因鱼.吗啉环寡聚核苷酸注射斑马鱼抑制GADD45B基因表达,则MTZ诱导的斑马鱼水肿发生率和蛋白尿水平显著降低. 结论:高表达GADD45B显著加重足细胞受损,而抑制GADD45表达则能有效改善足细胞损伤,提示其可作为治疗足细胞损伤药物靶点.

目的:探讨下调生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45β(growth arrest and DNA damage inducible protein 45β,GADD45β)表达对PC9肺腺癌细胞及吉非替尼敏感性的影响.方法:设计并合成GADD45β基因小干扰RNA(GADD45β-small interfering RNA,GADD45β-siRNA)序列,通过慢病毒介导将GADD45β-siRN转入PC9肺腺癌细胞中,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western印迹检测转染前后PC9肺腺癌细胞GADD45β的mRN及蛋白水平,采用膜联蛋白V(annexin V)-别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)双染流式细胞法检测转染后细胞凋亡水平;通过流式细胞术检测转染后细胞内DNA含量,计算转染后细胞各周期时相百分率,分析转染对细胞生长周期的影响;通过计数克隆形成数检测RNA干扰对细胞成瘤能力的影响;采用MTT法检测PC9肺腺癌细胞的吉非替尼半数抑制浓度IC50.结果:筛选出5'-AAATCCACTTCACG CTCAT-3‘为GADD45β基因RN干扰的有效序列.转染GADD45β-siRNA 48 h后,qRT-PCR和Western印迹结果显示PC9肺腺癌细胞GADD45β的mRNA和蛋白表达水平明显下调(均P＜0.05),细胞凋亡率明显增加(P＜0.05),且成瘤克隆数明显减少(P＜0.05);PC9肺腺癌细胞位于S期及G2/M期细胞增多(P＜0.05),吉非替尼的IC50明显下降(p＜0.05).结论:PC9肺腺癌细胞转染GADD45β-siRNA后,能成功下调GADD45β基因的mRNA和蛋白表达;下调GADD45β表达可降低PC9肺腺癌细胞的克隆形成能力,促进细胞凋亡;下调GADD45β表达可明显提高PC9肺腺癌细胞对吉非替尼的敏感性.

目的:检测转录因子E2F1与生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45g(GADD45g)基因在急性髓系白血病(AML)患者中表达的相关性,探讨GADD45g是否通过抑制E2F1诱导AML细胞DNA损伤、凋亡、衰老、周期阻滞和提高药物敏感性.方法:选取2013年1月至2016年12月中国医学科学院血液病医院初诊为AML患者32例骨髓标本及AML细胞系U937、HL60、THP-1和Molm-13,用qPCR检测组织和细胞中GADD45g和E2F1 mRNA的表达水平,并分析其相关性.构建E2F1过表达载体,并制备重组慢病毒在过表达GADD45g的Molm-13和THP-1细胞中过表达E2F1,通过彗星实验、Annexin V/7AAD流式细胞术、β-半乳糖苷酶染色和PI染色流式细胞术等确定GADD45g是否通过抑制E2F1对AML细胞发挥抑癌作用.结果:AML患者骨髓和细胞系中GADD45g和E2F1 mRNA的表达呈显著负相关(r=–0.663,P<0.01).GADD45g在AML细胞系中过表达显著抑制了E2F1的表达(均P<0.01).成功构建同时过表达GADD45g和E2F1的Molm-13和THP-1细胞,与对照组比较,过表达组细胞GADD45g和E2F1蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01).与过表达GADD45g的细胞相比,同时过表达GADD45g和E2F1细胞的凋亡、衰老率和DNA损伤水平均显著降低(均P<0.01);在过表达GADD45g的细胞中过表达E2F1逆转了GADD45g诱导的周期阻滞(均P<0.01),进而降低了过表达GADD45g对化疗药物的敏感性(均P<0.01).结论:GADD45g通过抑制E2F1在AML中发挥抗肿瘤作用.

目的 观察粪菌移植(FMT)对脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)的影响,探讨其可能的作用机制,为急性肺损伤的治疗提供新的思路.方法 成年健康雄性SPF级SD大鼠45只,按随机数字表法分为正常对照(NS)组、LPS组和FMT组,每组15只.采用腹腔注射LPS 5 mg/kg制ALI模型;FMT组于造模完成后灌胃粪菌液10 ml/kg(2次/d,连续2 d)进行干预.各组分别于干预结束后24 h、48 h、72 h随机处死5只大鼠,取肺组织行HE染色观察肺组织病理改变并对其进行病理学评分,取右肺检测肺湿/干重(W/D)比值,腹主动脉采血行PaO2分析,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6的含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织中转化生长因子-β(TGF-β)、胞内信号转导蛋白Samds(Smad3、7)mRNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)测定肺组织中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达量,收集大鼠粪便样品并提取DNA,对V3、V4区16S rDNA的PCR产物进行高通量测序,并对OTU为分类基础的微生物群落进行生物信息学分析.结果 LPS组与同时间点NS组比较,肺组织肺泡间隔明显增宽,可见大量炎性细胞浸润,部分肺泡腔萎陷不张;FMT组较LPS组大鼠肺组织炎性细胞浸润、肺间质肿胀程度明显减轻,正常肺组织结构破坏少.与NS组比较,LPS组肺W/D比值、PaO2、BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量在干预后24 h明显升高,随后逐渐降低,但仍高于NS组(P<0.05);FMT组肺W/D比值、PaO2及BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显少于同时间点LPS组(P<0.05).与NS组比较,肺组织中TGF-β1、Smad3在各时间点的表达增多,Smad7的表达减少(P<0.05);FMT组TGF-β1、Smad3的表达明显低于与同时间点LPS组(P<0.05),Smad7的表达明显高于同时间点LPS组(P<0.05).与同时间点NS组比较,LPS组p-ERK表达显著增加,其中第24小时表达量最高,第48和72小时逐渐降低(P<0.05);FMT组p-ERK表达显著低于同时间点LPS组(P<0.05).大便菌群测序结果揭示NS组含1362个OTU,LPS组含1443个OTU,FMT组含有1510个OTU,共享OTU为336个,共有的OTU所占百分比为26.4％.LPS组大鼠肠道菌群结构与正常大鼠肠道菌群结构具有显著不同,表现为较高的多样性指数,厚壁菌门/拟杆菌门比例增高、肠道菌群基因丰度降低,经过粪菌移植干预后FMT组肠道菌群结构接近正常对照组、厚壁菌门/拟杆菌门比例降低、菌群基因丰度增加(P<0.05).结论 粪菌移植可能通过调节肠道菌群并作用于TGF-β1/Smads/ERK通路,抑制免疫炎症反应,减少体内炎症因子的产生和释放,减轻肺泡上皮的损伤和异常修复,进而改善LPS诱导的大鼠内毒素性ALI.

目的 了解大鼠肝再生启动阶段CCAAT增强子结合蛋白3(CEBPβ)mRNA、miR-369-3p和mo-Rmdn2_0006调节肝细胞处于G0期还是G1期的途径和方法.方法 按Higgins等方法制备大鼠2/3肝切除(PH)模型,按Smedsrod等方法分离肝细胞,用大规模定量分析技术检测大鼠肝再生中肝细胞竞争性内源RNA(ceRNA)表达的变化,用Cytoscape 3.2软件构建ceRNA的相互作用网络,用ceRNA综合分析等方法解析它们表达的相关性和作用相关性.结果 PH后0h和6h时,CEBP3 mRNA的比值为1.11±0.11和2.57±0.10,miR-136-3p为0.70±0.22和0.28±0.03,rno-Rmdn2_0006为1.26±0.34和2.62±0.70.CEBPp促进的G0期相关基因生长停滞和DNA损伤诱导型β(GADD45β)为0.12±0.09和2.50±0.44,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(CDKN1A)为0.39±0.07和0.93±0.15,抑制的G0期相关基因细胞周期蛋白依赖性激酶2相关蛋白2(CDK2AP2)为2.55±0.42和0.74±0.11,信号转导子和转录激活因子1(STAT1)为2.57±0.13和1.32±0.13.CEBPβ促进的G1期相关基因ETS变异转录因子6(ETV6)为0.77±0.05和2.22±0.68,血红蛋白加氧酶1(HMOX1)为1.05±0.21和4.57±0.88,丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)为1.01±0.15和2.01±0.32,硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)为1.03±0.07和2.50±0.19,抑制的G1期相关基因红细胞衍生核因子2样蛋白2(NFE2L2)为0.66±0.09和0.35±0.05.结论 PH后0h时,CEBPβ mRNA未上调,有利于CEBPβ抑制的G0期相关基因表达和肝细胞处于G0期.相反,PH后6h时,rno-Rmdn2_0006和miR-369-3p通过相互作用解除了后者对CEBPp mRNA的抑制,有利于CEBPp形成,有利于CEBPβ促进的G1期相关基因表达和肝细胞处于G1期.