目的:探讨免疫抑制剂雷帕霉素对流感病毒复制的影响及在流感病毒感染后调节糖酵解和炎性因子的作用。方法:本研究为实验研究，采用甲型H1N1流感病毒株A/PR/8分别感染人肺泡上皮细胞系A549和永生化小鼠骨髓源巨噬细胞(iBMDM)，构建流感病毒感染细胞模型。使用人非小细胞肺癌细胞系A459设置空白对照组、感染对照组、感染雷帕霉素组、感染二甲亚砜组，在流感病毒感染及雷帕霉素处理48 h后，使用空斑法和血凝法测定上清液病毒滴度，定量聚合酶链反应法检测细胞内病毒基因、糖酵解相关基因(PDK3、PKM、GAPDH、LDHA、HK2、PGAM1、PGK1)和炎性因子干扰素α(IFN-α)、Caspase-1、白细胞介素(IL)-1β、IL-18、IL-6、IL-8、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)]基因相对量的表达。设置巨噬细胞空白对照组，巨噬细胞感染对照组和巨噬细胞感染雷帕霉素组，使用小鼠永生化骨髓巨噬细胞(iBMDM)在流感病毒感染及雷帕霉素处理24 h后，酶联免疫吸附测定法检测上清肿瘤坏死因子(TNF)-α浓度。进行3次平行重复实验。结果:感染雷帕霉素组A549细胞上清中的病毒滴度与感染对照组、感染二甲亚砜组比较差异均无统计学意义(均 P>0.05)。感染雷帕霉素组NP基因CT值较感染对照组和感染二甲亚砜组升高，分别为[(17.50±0.35)比(16.43±0.12)和(16.52±0.27)，差异有统计学意义，均 P<0.05]；感染对照组A549细胞上清中炎性因子基因GAPDH、LDHA、HK2、PGAM1表达量均较空白对照组上调，分别为[(2.34±0.32)比(1.01±0.16)、(2.43±0.18)比(1.01±0.18)、(2.63±0.48)比(1.00±0.06)，(17.97±1.13)比(1.00±0.09)差异有统计学意义，均 P<0.05]；与感染对照组相比，感染雷帕霉素组下调了GAPDH、LDHA、HK2、PGAM1的相对表达量，分别为[(1.48±0.19)比(2.34±0.32)、(1.79±0.09)比(2.43±0.18)、(1.65±0.28)比(2.63±0.48)、(10.48±0.81)比(17.97±1.13)，差异有统计学意义，均 P<0.05]；感染雷帕霉素组基因PDK3、PKM、PGK1与感染对照组比较差异无统计学意义(均 P>0.05)]。感染对照组A549细胞上清中Caspase-1、IL-6、IL-8基因的相对表达量较空白对照组上调，分别为[(47.02±2.07)比(1.00±0.09)、(17.59±2.14)比(1.00±0.04)、(3.86±0.44)比(1.01±0.19)，差异有统计学意义，均 P<0.05]。以感染复数＝20流感病毒感染iBMDM细胞24 h后，巨噬细胞感染对照组上清液中TNF-α的浓度较巨噬细胞空白对照组升高(260.60±38.90)ng/L比(44.96±3.12)ng/L，而巨噬细胞感染雷帕霉素组的TNF-α的浓度降低了(132.20±12.29)ng/L比(260.60±38.90)ng/L，差异有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:雷帕霉素减少流感病毒NP蛋白基因在肺泡上皮细胞中的表达，同时可有效减轻流感病毒感染引起的糖酵解通路激活，并降低感染后巨噬细胞炎症反应。

目的:探讨甲型流感病毒对缺少唾液酸残基巨噬细胞的侵染情况，并初步分析其对IFN表达的影响。方法:将PR8、Memphis、Aichi三种甲型流感病毒株以相同的病毒滴度分别侵染MHS肺泡巨噬细胞，对照组（NC）加等量PBS，24 h收集上清及细胞样本。采用RT-PCR法检测实验组病毒的负载量；普通倒置光学显微镜镜下观察实验组及NC细胞病变；实时荧光定量RCR法检测实验组及NC巨噬细胞样本中IFN-β、IFN-γ及Toll样受体3（TLR3）的表达水平，并进行统计学分析。结果:MHS巨噬细胞被3株甲型流感病毒株侵染后，镜下均观察到细胞病变，Aichi病变程度最强、Memphis次之、PR8最弱。在细胞和上清样本中检测到Aichi和Memphis核酸拷贝数较高（Aichi：胞内Ct=14.93，上清Ct=19.05；Memphis：胞内Ct=17.15，上清Ct=21.39），PR8拷贝数较低（胞内Ct=26.86，上清Ct=29.31）。与NC比较，3株病毒均诱导IFN-β高表达(Aichi/NC=210、Memphis/NC=93、PR8/NC=33)，同时抑制IFN-γ表达，差异均有统计学意义（ F=224.00和2 637.00， P均<0.001）。此外，Aichi诱导TLR3表达量升高（Aichi/NC=5.03），与NC比较，差异有统计学意义（ t=6.40， P=0.031）。 结论:尽管巨噬细胞表面缺少甲型流感病毒唾液酸受体，但仍可通过其他途径被病毒侵染，并影响其胞内病毒RNA识别受体和IFN的表达，不同毒株之间的侵染能力存在较大差异。

目的:基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法:构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒，将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后，单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠，并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后，分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒，通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果:单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较，免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论:单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。

目的 基于PR8感染所致病毒性肺炎小鼠模型,探寻葛根汤颗粒抗流感病毒性肺炎损伤的作用机制.方法 32只雌性SPF级ICR小鼠随机分为空白组、模型组、奥司他韦组、葛根汤颗粒组,每组8只.滴鼻法建立PR8毒株感染所致病毒性肺炎小鼠模型,计算肺指数和肺指数抑制率,应用光镜观察各组肺组织病理变化,运用ELISA和Western blotting法检测各组肺组织炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、细胞间黏附分子-1(ICAM1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM1)和炎性免疫蛋白人肿瘤坏死因子受体-1(TNFR1)、核转录因子-κB(NF-κB)、Jun氨基末端激酶(JNK1)表达情况.结果 与模型组比较,奥司他韦组和葛根汤颗粒组可降低小鼠肺指数(P＜0.001),葛根汤颗粒组对肺指数抑制效果优于奥司他韦组.病理提示,与模型组比较,葛根汤颗粒组可显著减轻支气管炎症反应渗出,减轻肺泡、肺间质和红细胞渗出.ELISA结果显示,与模型组比较,奥司他韦组和葛根汤颗粒组可显著降低IL-6、ICAM1、VCAM1的表达(P＜0.001);与奥司他韦组相比,葛根汤颗粒组IL-6含量降低(P＜0.01).Western blotting结果显示,与模型组比较,奥司他韦组和葛根汤颗粒组可降低TNFR1、JNK1蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01),葛根汤颗粒可降低NF-κB蛋白的表达(P＜0.05).结论 葛根汤颗粒可以降低甲型流感病毒感染小鼠肺组织中IL-6、ICAM1、VCAM1、TNFR1、NF-κB、JNK等炎性因子和炎性免疫蛋白的表达,调节炎症和免疫紊乱,为仲景经典处方临床应用提供基础理论依据.

背景 甲型流感病毒传染性强,重症感染病死率高.共信号分子是参与免疫应答的重要分子.探究甲型流感病毒感染后肺病毒载量与共信号分子的变化特点及相关性可为病毒感染后的治疗提供参考依据.目的 探究甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8株)感染小鼠肺病毒载量和共信号分子的变化特点及相关性.方法 72只 7周龄BALB/c小鼠随机分为高剂量病毒组(108 TCID50/mL,50 μL/只,32只)、低剂量病毒组(104 TCID50/mL,50 μL/只,32只)和对照组(PBS,50 μL/只,8只),三组分别于感染后 24 h、48 h、72 h和 96h每个时间点每组各处死 8只、8只、2只小鼠;解剖取左肺行HE染色,实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测肺病毒载量以及共信号分子CD28、CD226、ICOS、CTLA-4、TIGIT、PD-1 mRNA相对表达量.将高、低剂量病毒组所有病毒感染小鼠(n=64)肺病毒载量与共信号分子mRNA相对表达量行相关性分析.结果 感染后 96h内,高剂量病毒组相比低剂量病毒组小鼠肺损伤较重,且共刺激分子CD28、CD226、ICOS mRNA相对表达量均减少(P均＜0.05).高剂量病毒组小鼠感染后 24 h PD-1 mRNA相对表达量增加(P＜0.01),感染后 48 h CTLA-4 mRNA相对表达量增加(P＜0.01)且病毒复制达到峰值.低剂量病毒组小鼠感染后 72 h PD-1 mRNA相对表达量增加(P＜0.05)且病毒复制达到峰值,感染后 96 h CTLA-4 mRNA相对表达量增加(P＜0.01).病毒感染小鼠(n=64)肺病毒载量与PD-1 mRNA相对表达量存在正相关关系(r=0.540,P＜0.001),与CD226 mRNA相对表达量存在负相关关系(r=-0.340,P=0.006).结论 甲型流感病毒感染小鼠肺组织中CTLA-4、PD-1 mRNA相对表达量增加等现象的早期出现可能提示小鼠感染的重症化.肺组织中的PD-1和CD226可能是与肺病毒载量相关的共信号分子靶点.

目的 建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用.方法 利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至 50 代以上进行形态学观察并与 40 代细胞形态进行比较,波形蛋白(vimentin)和SV40T基因免疫荧光鉴定、核型鉴定、细胞增殖曲线测定.用单纯疱疹病毒 1 型(herpes simplex virus-1,HSV-1)(McKrae株)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)(GZ01 株)、登革病毒Ⅱ型以及甲型流感病毒H1N1(PR8 株)在该细胞上进行病毒感染实验.结果 传至 50 代以上的树鼩永生化CSCs呈梭形,细胞形态结构与 40 代相比仍较好.vimentin和SV40T基因免疫荧光表达阳性.增殖曲线结果显示:细胞生长旺盛,第4～5 天时处于对数生长期.原代细胞核型的染色体数稳定为 62 条,而永生化细胞第 21、56 代突变为64 条且保持稳定.病毒感染实验显示:树鼩永生化CSCs对HSV-1(McKrae株)、ZIKV(GZ01 株)、登革病毒Ⅱ型以及H1N1(PR8 株)病毒敏感,产生较高感染滴度,分别为 1.32×105、5.62×106、2.69×107、7.76×104 CCID50/mL.结论 成功建立了树鼩永生化CSCs细胞系,提示该细胞系可用于单纯疱疹病毒、寨卡病毒、登革病毒和甲型流感病毒感染眼角膜疾病的作用机制及抗病毒药物的研究.

目的 比较甲型流感病毒抗原即时检验(POCT)免疫荧光法、乳胶免疫层析法和免疫胶体金法的临床诊断效能.方法 以qRT-PCR为诊断标准,比较3种甲型流感病毒抗原POCT对甲型流感病毒的检出限、分析特异性和在临床样本检测中的诊断灵敏度和诊断特异性.结果 免疫荧光法、乳胶免疫层析法和免疫胶体金法对H1N1pdm09 的检出限分别为 1∶10000、1∶1 000 和 1∶100,对季节性流感 H1N1、H1N1(PR8 株)、H3N2(Aichi 株)、禽流感病毒H6N2和H7N3的检出限分别为1∶100 000、1∶10 000和1∶1 000.检出限从低到高依次为免疫荧光法、乳胶免疫层析法和免疫胶体金法.3种甲型流感病毒抗原POCT对除甲流外的25种临床呼吸道感染常见病原体均无交叉反应.与qRT-PCR相比,免疫荧光法、乳胶免疫层析法、免疫胶体金法的诊断灵敏度分别为74.63％、56.72％和40.30％,免疫荧光法的诊断灵敏度高于乳胶免疫层析法,差异有统计学意义(x2=46.13,P＜0.05),免疫荧光法的诊断灵敏度高于免疫胶体金法,差异有统计学意义(x2=71.94,P＜0.05),乳胶免疫层析法的诊断灵敏度高于免疫胶体金法,差异有统计学意义(x2=103.54,P＜0.05).免疫荧光法、乳胶免疫层析法、免疫胶体金法的诊断特异性分别为96.41％、100.00％、100.00％,受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.86、0.78和0.70.结论 免疫荧光法在3种甲型流感病毒抗原POCT中表现最佳,具有最低的检出限、最高的诊断灵敏度和AUC,以及较好的分析特异性和诊断特异性,可满足临床对甲型流感病毒抗原的快速检测需求.

目的 通过C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)亲本品系小鼠流感感染后相关表型及杂交子代BXD小鼠肺脏转录本数据的系统性分析进行基因筛选,以找到在流感病毒感染中发挥作用的候选基因.方法 共选取41个BXD小鼠及亲本品系B6和D2的雌性小鼠,在8～12周龄之间给予流感病毒甲型鼠肺适应株(H1N1,PR8M)得到相关表型及基因表达量数据,对基因表达量进行聚类分析及加权基因共表达网络分析,构建模块特征值与小鼠病毒载量的相关性,经表达数量性状座位分析,皮尔逊相关性分析,结合全基因组关联研究(GWAS)、小鼠基因组信息学(MGI)、国际小鼠表型联合会(IMPC)三个基因数据库中的信息分析筛选流感病毒感染相关的候选功能基因及确定该基因的遗传调控方式;最后将挑选出的基因进行通路富集分析.结果 通过聚类分析和加权基因共表达网络分析,将24 219个基因分为23个模块;通过模块与表型的相关性分析,发现MEred、MEgreen、MEma-genta模块与感染密切相关,将其作为核心模块;对核心模块基因通过KEGG和MPO富集分析,结果显示流感病毒相关基因显著参与MAPK信号通路、TNF信号通路等多个细胞免疫相关通路;对核心模块内基因与BXD小鼠流感病毒感染的3种表型(体质量减轻,平均死亡时间和感染后体质量减轻中位数)进行相关性分析,共发现21个基因的肺mRNA表达水平与3种表型均相关(P＜0.05);进一步通过GeneNetwork中GEMMA算法对这21个基因行表达数量性状座位分析,结果表明Acpl2受顺式遗传调控,Dusp12、Ovol2、Catsper4、Tmc5、Acsm 1、Fam81a、Rtn4、Rhpn1受反式遗传调控;通过结合MGI,IMPC,GWAS三个基因数据库中的信息分析发现部分基因在免疫通路方面发挥作用.结论 通过系统遗传学分析,在小鼠基因组上鉴定了影响流感病毒感染相关的21个候选基因,后续可做进一步的功能验证来阐明其参与流感病毒感染的遗传调控机制.

目的 观察甲型流感病毒H1N1感染小鼠的一般状态、肺组织病理、肠组织病理、结肠转录组、肠内容物代谢组的变化,探究甲型流感病毒H1N1感染致小鼠肠道损伤的机制.方法 用流感病毒PR8感染C57BL/6J小鼠,留取感染后第7天肺组织、结肠组织和盲肠内容物,计算肺指数,测量结肠长度,采用苏木素-伊红染色观察肺、肠组织病理,RNA-seq法进行结肠转录组测序,非靶向代谢组学检测盲肠内容物.结果 感染模型组小鼠较空白对照组小鼠体质量减轻、活动减少,肺指数增加,结肠长度缩短,肺、结肠组织病理出现损伤.空白对照组和感染模型组小鼠共有1609个差异基因,437个差异代谢物,这些差异基因和差异代谢物共同富集到的通路包括花生四烯酸代谢通路和色氨酸代谢通路.结论 甲型流感病毒感染可能通过改变小鼠结肠内基因表达水平和盲肠内的代谢产物造成小鼠肠道损伤.

目的 探讨香雪抗病毒口服液对甲型流感病毒的活性及其在炎症免疫应答中的潜在作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)染色法检测香雪抗病毒口服液对MDCK细胞和A549细胞的细胞毒性作用.采用细胞病变抑制法(CPE)及空斑减少实验对香雪抗病毒口服液进行抗病毒活性检测.采用免疫荧光法检测 NP 蛋白.实时荧光定量PCR测定炎症细胞因子的表达情况.采用蛋白印迹实验检测香雪抗病毒口服液对炎症相关信号通路的蛋白表达的影响.结果 香雪抗病毒口服液对甲型流感病毒 A/PR/8/34(H1N1)和 A/Aichi/2/68(H3N2)均有一定的抗病毒抑制作用,半数细胞毒性浓度(TC50)分别为42.12、79.36 mg/mL,半数抑制浓度(IC50)分别为 8.665、5.260 mg/mL,并可减少H1N1 病毒空斑形成.香雪抗病毒口服液能呈剂量相关性地降低H1N1诱导的A549 细胞炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I(RIG-I)、趋化因子(CC基序)配体 5(CCL5)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1 β)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、白细胞介素-10(IL-10)、λ干扰素(IFN-λ)、β干扰素(IFN-β)、白细胞介素-8(IL-8)mRNA的表达(P＜0.05、0.01、0.001).在流感病毒单复制周期中,香雪抗病毒口服液在早期阶段 0～2 h干预,具有良好的抗流感病毒效果.香雪抗病毒口服液能显著抑制Toll样模式识别受体 3(TLR3)、RIG-I、黑色素瘤分化相关基因 5(MDA-5)受体的表达,下调核转录因子-κB亚基p65(NF-κB p65)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、信号转导和转录激活因子 1(STAT1)、STAT2、STAT3 的磷酸化水平,且在 20 mg/mL浓度下明显下调这些蛋白的表达.结论 香雪抗病毒口服液不仅能有效抑制甲流感病毒在人宿主细胞中复制,降低流感病毒诱导的炎症因子表达,而且能显著抑制流感病毒诱导天然免疫信号通路的相关蛋白表达,表明香雪抗病毒口服液具有防治流感病毒的潜力.