目的:构建具有损伤再生能力的新型小肠类器官，体外模拟肠道损伤、再生和修复过程。方法:分离6～8周龄、18～24 g无特定病原体动物级C57BL/6小鼠回肠黏膜隐窝结构，设计ENR、ENR＋肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和8C培养体系，分别构建肠道稳态、炎症损伤和损伤再生条件下的小肠类器官并观察形态。通过免疫荧光染色检测类器官包含的细胞类型和空间排布，以及损伤再生基因凝集素蛋白( Clu)、膜联蛋白A1( Anxa1)、干细胞抗原1( Sca1)和小鼠再生胰岛衍生蛋白3β( Reg3 b)的蛋白质表达情况。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 Clu、 Anxa1、 Sca1、 Reg3 b的mRNA表达情况。统计学方法采用独立样本 t检验。 结果:8C和ENR培养体系下的小肠类器官均包含肠道干细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠道内分泌细胞，细胞空间排布与肠上皮基本一致。8C培养体系下的新型小肠类器官的扩增能力较ENR、ENR＋TNF-α培养体系下的小肠类器官明显增强，生长速度更快，结构更大、更复杂。qRT-PCR结果显示，8C培养体系下的新型小肠类器官再生基因 Clu、 Anxa1和 Sca1的mRNA相对表达水平均高于ENR和ENR＋TNF-α培养体系(0.68±0.31比0.20±0.07、0.36±0.19，0.48±0.13比0.07±0.02、0.18±0.11，0.56±0.20比0.02±0.01、0.08±0.04)，差异均有统计学意义( t＝4.82、2.77，8.62、4.89，8.58、7.50；均 P<0.05)。免疫荧光检测显示，8C培养体系下的新型小肠类器官再生基因 Clu、 Anxa1、 Sca1和 Reg3 b的蛋白质表达水平均高于ENR、ENR＋TNF-α培养体系(31.62±1.69比9.73±2.39、15.11±2.16，42.65±1.85比19.70±1.18、24.97±2.82，63.80±2.73比37.10±1.59、43.27±2.53，53.26±1.84比27.75±3.78、33.16±3.50)，差异均有统计学意义( t＝12.95、10.41，18.13、9.09，14.63、9.56，10.51、8.80；均 P<0.001)。 结论:新型培养体系下建立的小肠类器官具备损伤再生特征，为研究上皮组织器官再生提供了新的体外模型。

目的:探讨粪菌移植（FMT）治疗糖皮质激素耐药胃肠道急性移植物抗宿主病（GI-aGVHD）的临床疗效。方法:纳入2017年3月至2022年3月期间在徐州医科大学附属淮安医院行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后发生糖皮质激素耐药GI-aGVHD的29例血液病患者，其中19例行FMT治疗（FMT组），10例未接受FMT治疗（对照组）。观察疗效及安全性，分析FMT治疗前后肠道菌群丰度、淋巴细胞亚群比例、外周血炎症因子及GVHD生物标志物的变化。结果:①13例患者（68.4%）在FMT后临床症状达到完全缓解，对照组2例患者（20.0%）达到完全缓解，差异有统计学意义（ P<0.05）。FMT后肠道微生物群多样性增加，并逐渐恢复至正常水平，未发生FMT相关感染。②与对照组比较，FMT组治疗后CD3 +、CD8 +细胞占比降低，CD4 +、调节性T细胞（Treg）及CD4 +/CD8 +细胞比值升高（ P值均<0.05），IL-6浓度低于对照组[4.15（1.91~5.71）ng/L对6.82（2.40~8.91）ng/L， P=0.040]，IL-10浓度高于对照组[12.11（5.69~20.36）ng/L对7.51（4.10~9.58）ng/L， P=0.024]。胰岛衍生蛋白3α（REG3α）在发生GI-aGVHD时明显升高，FMT组治疗后REG3α水平低于对照组[30.70（10.50~105.00）μg/L对74.35（33.50~139.50）μg/L， P=0.021]。 结论:FMT是糖皮质激素耐药GI-aGVHD的有效、安全治疗方法。FMT可促进肠道菌群多样性的恢复、调节炎症因子和上调Treg细胞表达。

目的 探讨金合欢素调节胰岛素受体底物-1(IRS-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路对糖尿病大鼠胰岛素抵抗(IR)的影响.方法 选取6周龄,体质量220～235 g的SPF级SD雄性大鼠60只作为研究对象.随机选出12只大鼠作为对照组(NC组),其余48只大鼠构建2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,造模成功后随机分为糖尿病组、金合欢素组、MG53组、金合欢素+MG53组,每组12只.检测所有大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三脂(TG)水平.采用酶联免疫吸附试验检测空腹胰岛素(FINS)水平以及胰腺组织白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,计算胰岛素敏感指数(ISI)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);计算口服葡萄糖耐量实验曲线下面积(AUC);采用苏木精和伊红(HE)染色检测 胰腺组织病理变化;采用 Western blot法检测IRS-1/PI3K/AKT通路蛋白表达水平.结果 与NC组相比,糖尿病组大鼠体质量、FBG、TC、TG、LDL水平均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组大鼠体质量、FBG、TC、TG、LDL水平均明显下降,而MG53组均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组大鼠体质量、FBG、TC、TG、LDL水平均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).与NC组相比,糖尿病组FBG、FINS、HOMA-IR水平均明显升高,AUC明显增大,ISI水平明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组FINS、HOMA-IR水平均明显下降,AUC明显减小,ISI水平明显升高,而MG53组FINS、HOMA-IR水平均明显升高,AUC明显增大,ISI水平明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组FINS、HOMA-IR水平均明显升高,AUC明显增大,ISI水平明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).与NC组相比,糖尿病组TNF-α、IL-1β水平均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组TNF-α、IL-1β水平均明显下降,而MG53组TNF-α、IL-1β水平均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组TNF-α、IL-1β水平均明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).HE染色结果显示,NC组大鼠胰腺组织染色清晰,结构正常,可以观察到明显的外分泌腺泡和胰岛、小叶内导管和小叶间导管;与NC组相比,糖尿病组观察到血管充血、腺泡和小叶内导管聚集有炎症细胞;与糖尿病组相比,金合欢素组炎症细胞浸润现象减少,而MG53组小叶内和小叶间导管中观察到重度炎症细胞聚集;金合欢素+MG53组胰腺结构与糖尿病组相似.与NC组相比,糖尿病组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病组相比,金合欢素组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 蛋白水平均明显升高,而 MG53 组 p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);与金合欢素组相比,金合欢素+MG53组p-IRS-1/IRS-1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 金合欢素可能通过上调IRS-1/PI3K/AKT信号通路发挥减轻糖尿病大鼠IR的作用.

目的:基于生物信息学技术探讨G蛋白偶联受体176(GPR176)在胃癌中的表达水平,挖掘其预测胃癌预后和免疫检查点阻断剂应答的潜力.方法:利用R软件比较TCGA-STAD和GEO数据集中胃癌组织和正常胃组织中GPR176 mRNA的表达,调取Human Protein Atlas中免疫组化图谱,比较胃癌组织和正常胃组织中GPR176 蛋白的表达.利用TCGA-STAD数据集分析不同临床特征胃癌患者GPR176 mRNA表达的差异.利用TCGA-STAD和GEO数据集分析GPR176 mRNA表达水平预测胃癌预后及免疫检查点阻断剂应答的价值.结果:与正常胃组织比较,胃癌组织中GPR176 mRNA和蛋白表达水平均上调,且与胃癌患者的不良临床特征有关.GPR176 mRNA高表达患者总生存期短于低表达者;ROC曲线分析表明,GPR176 mRNA对胃癌 1、3、5 a生存率具有较高的预测价值.GPR176 mRNA高表达患者免疫细胞(未激活NK细胞和M2 巨噬细胞)的浸润丰度高,免疫表型评分低.结论:GPR176 在胃癌组织中高表达,可作为潜在的预测胃癌预后和免疫检查点阻断剂应答的新型分子标志物.

[背景]氯菊酯是一种常用的拟除虫菊酯类杀虫剂,研究发现其具有潜在神经系统毒性.小胶质细胞是中枢神经系统中的天然免疫细胞,参与一系列神经退行性疾病的发生.[目的]本研究观察氯菊酯在体外对人小胶质细胞HMC3的毒性效应,并探讨其机制.[方法]使用 0、10、25、55 μmol·L-1 的氯菊酯染毒HMC372 h后,使用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞周期蛋白依赖性激酶 1基因(CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 1A基因(CDKN1A)、细胞周期蛋白B2基因(CCNB2)、肿瘤蛋白p53基因(p53)、凋亡相关因子基因(FAS)、胱天蛋白酶 3基因(CASP3)和H2A变体组蛋白基因(H2AX)的表达.转录组测序(RNA-seq)检测 0、25 μmol·L-1 氯菊酯染毒后HMC3的差异基因和富集通路.再次使用 0、10、25、55 μmol·L-1 的氯菊酯染毒HMC372 h后,使用格里斯试剂法检测上清中一氧化氮(NO)含量,酶联免疫吸附法检测白细胞介素(IL)-6的分泌水平,qPCR检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路(包括MAPK1、MAPK8、MAPK14)、IL-1β、IL-6和基质金属蛋白酶(MMP)家族(包括MMP1、MMP2、MMP3和MMP9)的mRNA表达情况,蛋白质印记法(Western blot)检测磷酸化p38(p-p38)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、IL-1β、IL-6和MMP1蛋白表达情况.[结果]0、10、25、55 μmol·L-1 氯菊酯染毒细胞后,HMC3在G2/M期阻滞,其中 55 μmol·L-1 氯菊酯染毒组与对照组差异有统计学意义(P<0.01),qPCR结果显示CDKN1A mRNA表达较对照组上调(P<0.05).各组细胞凋亡比例差异无统计学意义(P>0.05).RNA-seq结果提示差异基因富集于MAPK通路.qPCR结果提示 55 μmol·L-1 染毒组MAPK1、MAPK8和MAPK14的mRNA表达较对照组上调(P<0.05).Western blot发现,与对照组相比,10 μmol·L-1 氯菊酯染毒组的p-p38和p-ERK水平均升高(P<0.05),25 μmol·L-1 氯菊酯染毒组的p-ERK水平升高(P<0.05),55 μmol·L-1 氯菊酯染毒组的p-p38水平升高(P<0.05).与对照组相比,染毒后的HMC3上清液中NO分泌量增加(P<0.05),IL-6的mRNA、蛋白表达和分泌量呈上升趋势,IL-1β的mRNA和蛋白表达上调(P<0.05),25、55 μmol·L-1 组MMP1的mRNA和蛋白表达上调(P<0.05).[结论]氯菊酯在体外抑制HMC3细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,可激活MAPK通路,促进炎症因子IL-1β以及MMP1表达,可能是氯菊酯致人神经毒性的机制之一.

目的 通过C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)亲本品系小鼠流感感染后相关表型及杂交子代BXD小鼠肺脏转录本数据的系统性分析进行基因筛选,以找到在流感病毒感染中发挥作用的候选基因.方法 共选取41个BXD小鼠及亲本品系B6和D2的雌性小鼠,在8～12周龄之间给予流感病毒甲型鼠肺适应株(H1N1,PR8M)得到相关表型及基因表达量数据,对基因表达量进行聚类分析及加权基因共表达网络分析,构建模块特征值与小鼠病毒载量的相关性,经表达数量性状座位分析,皮尔逊相关性分析,结合全基因组关联研究(GWAS)、小鼠基因组信息学(MGI)、国际小鼠表型联合会(IMPC)三个基因数据库中的信息分析筛选流感病毒感染相关的候选功能基因及确定该基因的遗传调控方式;最后将挑选出的基因进行通路富集分析.结果 通过聚类分析和加权基因共表达网络分析,将24 219个基因分为23个模块;通过模块与表型的相关性分析,发现MEred、MEgreen、MEma-genta模块与感染密切相关,将其作为核心模块;对核心模块基因通过KEGG和MPO富集分析,结果显示流感病毒相关基因显著参与MAPK信号通路、TNF信号通路等多个细胞免疫相关通路;对核心模块内基因与BXD小鼠流感病毒感染的3种表型(体质量减轻,平均死亡时间和感染后体质量减轻中位数)进行相关性分析,共发现21个基因的肺mRNA表达水平与3种表型均相关(P＜0.05);进一步通过GeneNetwork中GEMMA算法对这21个基因行表达数量性状座位分析,结果表明Acpl2受顺式遗传调控,Dusp12、Ovol2、Catsper4、Tmc5、Acsm 1、Fam81a、Rtn4、Rhpn1受反式遗传调控;通过结合MGI,IMPC,GWAS三个基因数据库中的信息分析发现部分基因在免疫通路方面发挥作用.结论 通过系统遗传学分析,在小鼠基因组上鉴定了影响流感病毒感染相关的21个候选基因,后续可做进一步的功能验证来阐明其参与流感病毒感染的遗传调控机制.

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)核旁丛组装转录本1(NEAT1)在狼疮性肾炎(lupus ne-phritis,LN)中通过微小RNA(miR)-182-5p/叉头盒蛋白O1(FoxO1)/β-连环蛋白(β-catenin)轴对肾系膜细胞损伤的影响.方法 收集2019年3月至2021年7月凉山州第二人民医院收治的32例LN患者(LN组)外周血和32例体检健康者(健康对照组)外周血,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测外周血单个核细胞中NEAT1以及miR-182-5p、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β含量.采用20％LN患者血清处理肾系膜细胞的方法构建LN肾系膜细胞模型,造模完成后将细胞分为对照组(正常培养,不转染)、模型组(加入5 μg/mL脂多糖培养)、si-NC组(转染si-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1组(转染si-NEAT1后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-NC组(共转染si-NEAT1和anti-miR-NC后加入5 μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-182-5p组(共转染si-NEAT1和anti-miR-182-5p后加入5μg/mL脂多糖培养).qRT-PCR法检测各组细胞NEAT1、miR-182-5p表达水平;ELISA法测定各组细胞炎症因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞LDH含量;细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞增殖活力;流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况;免疫印迹法检测各组细胞FoxO1、β-cate-nin蛋白表达水平.结果 与健康对照组比较,LN组患者外周血单个核细胞中NEAT1、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平以及血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著上升,miR-182-5p表达水平显著下降(P＜0.05).与对照组比较,模型组肾系膜细胞增殖活力、FoxO1和β-catenin蛋白水平以及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明显增加,miR-182-5p表达水平明显降低(P＜0.05).敲低NEAT1后,细胞增殖活力和炎症反应减弱,FoxO1和β-catenin蛋白表达明显下调(P＜0.05);抑制miR-182-5p表达可减轻NEAT1敲低对LN肾系膜细胞模型细胞增殖、炎症因子及FoxO1、β-catenin蛋白表达的影响(P＜0.05).各组细胞间凋亡率无显著变化(P＞0.05).结论 敲低NEAT1可通过靶向负调控miR-182-5p表达,抑制LN肾系膜细胞过度增殖,降低炎症反应,其可能与抑制FoxO1/β-catenin通路有关.

为探讨NAC转录因子在梨缺铁黄化叶复绿过程中的表达特性,筛选响应该过程的核心NAC因子,以清水处理正常梨树叶片(N)和黄化梨树叶片(C)为对照(CN和Cc),探讨外源0.2％FeSO4溶液对梨缺铁黄化叶Fe2+积累的影响,研究其关键PbrNAC基因的生物学性质、组织表达特异性以及复绿过程中的表达模式,阐述其与叶内Fe2+积累的关联性.结果表明,(1)于N和C内共鉴定到含NAM结构域的21个显著差异表达的PbrNAC基因,涉及8个亚族,其长度不均,motif数从4～9不等,内含子数较少;(2)该基因倾向于根中表达,且均可响应缺铁黄化叶的复绿,其中 Pbr032231.1、Pbr021393.1、Pbr026635.1、Pbr038615.1、Pbr019210.3、Pbr019212.1、Pbr002372.1这7个基因在Cc内的表达量显著低于CN内表达量,且FeSO4处理后,各时期表达量均较Cc显著上调;与之相反,Pbr007284.1、Pbr016205.1、Pbr007673.1等14个PbrNAC基因均在Cc内显著高表达,而FeSO4处理后,各时期表达量总体较Cc显著下降;(3)各叶样内Fe2+含量与Pbr007284.1、Pbr016205.1、Pbr007673.1基因的表达量均呈显著负相关,且该3个基因表达与Pbr016932.1、Pbr027956.1、Pbr029956.1、Pbr026635.1等基因表达显著相关;(4)多数PbrNAC在正常梨树根系和黄化梨树根系中的表达趋势与其在CN和Cc内的表达趋势基本一致,说明其在地下部根系与地上部叶内可能存在表达协同性.以上结果表明,梨PbrNAC基因可能与梨树缺铁胁迫响应和缺铁黄化叶的复绿相关,其中Pbr007284.1、Pbr016205.1、Pbr007673.1可能起重要调控作用.

目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在成骨细胞骨形成中的负向调节作用及其可能作用机制.方法:离体培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞系,以10 μg/L的甲状旁腺激素(PTH)或TGF-β1处理细胞6、12、24 h后,应用荧光定量PCR检测硬骨素(SOST)和 TGF-β受体 ALK5 mRNA表达变化;取对数生长期的 MC3T3-E1细胞进行ALK5-siRNA转染,荧光定量 PCR 及 Western blot 法检测 ALK5-siRNA 转染对 TGF-β1作用下 MC3T3-E1细胞中SOST mRNA和Smad2/3蛋白表达的影响.结果:在10 μg/L浓度的 TGF-β1诱导下,MC3T3-E1细胞中 SOST和ALK5 mRNA表达水平均较对照组升高(P<0.05),且表达水平均随着处理时间的延长而上调(P<0.05).沉默ALK5可部分抑制TGF-β1诱导的SOST mRNA和Smad2/3蛋白表达上调(P<0.05).结论:TGF-β1可通过激活Smad2/3信号通路上调SOST表达,从而抑制成骨细胞骨形成.

OBJECTIVE Based on the methods of microdialysis,HPLC-MS/MS and gene chip tech-nology,the mechanism of Baicalin and Geniposide(BC/GP)against excitatory amino acid toxicity in ce-rebral ischemia was studied. This will provide guidance for the clinical application of BC/GP and the study of excitatory amino acid toxicity in cerebral ischemia.METHODS (1)Microdialysis technique and HPLC-MS/MS was performed to study the pharmacodynamics of BC/GP against cerebral ischemia. ①18 SD rats with body weight of(280±20)g were randomly divided into control group,treatment groups with BC/CP at low dose,medium dose and high dose(equal to the dosage of crude drugs for 30 mg·kg-1, 45 mg·kg-1and 60 mg·kg-1respectively).Rats in each group were given intragastric administration for seven days to establish cerebral ischemia model. Then, microdialysis probe was applied to collect cerebrospinal fluid from hippocampus before and after cerebral ischemia. ② First, we established the HPLC-MS/MS method for measuring drugs and excitatory amino acids.Then we detected the microdi-alysis samples and observed their changes in animals.(2)The mechanism of BC/GP against excitatory toxicity of cerebral ischemia were observed at gene level by chip technique. ① 16 SD rats with body weight of 240±20 g were randomly divided into sham group, model group, treatment group of BC(60 mg·kg-1),treatment group of GP(60 mg·kg-1)and treatment group of BC/GP(7:3)(60 mg·kg-1).Rats in eachgroup were given intragastric administration for seven days to establish cerebral ischemia model. Then the rats were sacrificed,and the hippocampus were rapidly harvested and stored at-80℃for further detection. ②After the quality inspection of the hippocampal,the qualified samples were subjected to detect the levels of neurotransmitter receptor gene in the ischemic of rats by gene chip technology.Finally,the results were analyzed by the method of Δ ΔCt.RESULTS (1)Only three compounds includ-ed GP,glutamic acid and aspartic acid were detected in microdialysis samples by HPLC-MS/MS.The concentration of GP increased and lasted for 120 min with a significant dose-dependent after cerebral ischemia.Compared with low dose group,the AUC(0-t),MRT(0-∞),Cmaxand t1/2zin high-dose group showed significant difference(P<0.01).Compared with the model group,the levels of glutamic acid and aspartic acid in the treatment groups decreased significantly,especially in the middle and high dose groups.(2) 89 genes in the neurotransmitter receptor gene signaling pathway were detected by gene chip technol-ogy. There were 22 genes with |Fold Regulation|>1.5 in the model group, compared with the sham group.Five of the 22 genes showed statistically significant differences,including Grin2c(2.9026),Chrna7 (-1.5877), and Tacr2 (-1.7695). Htr3a (-1.8172) and Grm6 (-2.3527). There were 5 genes with |Fold Regulation|>1.5 in the BC group, compared with the model group, Two of them exhibited statistically significant differences,including Brs3(1.797)and Grin2c(-1.7979).There were 14 genes with|Fold Reg-ulation|>1.5 in the GP group, compared with the model group. Three of them displayed statistically significant differences,including Hcrtr2 (-1.6584), Sctr (-3.8524) and Grin2c (-4.8408). Compared with model group, the genes of |Fold Regulation|>1.5 in BC/GP (7:3) group are 5, and only one of them showed a significant differences. CONCLUSION (1)After administration of BC and GP,GP can cross the blood-brain barrier and reduce the release of excitatory amino acids in the hippocampus. (2) BC/GP can inhibit the interaction between excitatory amino acids and excitatory amino acid receptors and attenuate the toxicity of excitatory amino acids by down-regulating the expression of glutamic acid receptor Grin2c gene.(3)BC/GP may exert their brain protection effect by reducing the release of excit-atory amino acids and inhibiting the expression of excitatory amino acid receptors.