目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:探讨不同粒径大小对γ辐照中脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）中胶原结构的影响以及辐照保护剂的有效性。方法:取同一供体的冻干皮质骨，依据Urist改良法制备不同粒径的（0.5~1.0 mm、1.2~2.8 mm、3.3~4.7 mm及5.7~7.0 mm）DBM样品，按照不同剂量分为：0 kGy、15 kGy、25 kGy及25 kGy（辐照保护剂），真空密封后储存于-80℃冰箱待用。通过扫描电镜观察胶原表面形态，大体观察胶原表面结构损伤的程度；将样品按照0.2 g/ml生理盐水比例在50℃条件下72 h，利用浸提液颜色深度观察胶原被辐照损伤的程度；使用2，4-二硝基苯肼（吸光光度计法）测定样品中羰基含量；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺钠凝胶电泳法（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）测定样品中胶原分子量的变化；利用差示热量扫描法（differential scanning calorimetry，DSC）检测样品热变性温度以观察胶原热稳定性。结果:样品浸提液颜色与γ辐照剂量相关度较高，未辐照样品浸提液颜色清亮，而在同粒径下随辐照剂量加大浸提液黄色逐渐加深，5.7~7.0 mm粒径组颜色相对较浅；25 kGy组相比于25 kGy+保护剂组浸提液颜色加深。扫描电镜观察到γ辐照导致胶原结构紊乱，纤维断裂，随着辐照剂量增大损伤区域增多，当粒径增大时，损伤区域有减少的趋势；相比于25 kGy组，25 kGy+保护剂组胶原结构性破坏减少。差示热量扫描法得出样品热交换曲线，随着粒径增大，热变性温度有增高的趋势，粒径间对比有统计学差异（ F=189.4， P<0.001）；同粒径间差异不明显。SDS-PAGE发现同粒径下γ辐照剂量愈大，胶原分子量愈小；同辐照条件下随粒径较小，高分子量胶原含量减少明显；225 kGy+保护剂组相比于25 kGy组，高分子量增多。羰基含量结果显示在同一粒径下，γ辐照使羰基含量增多，0.5~1.0 mm组（ F=13.631， P=0.002），1.2~2.8 mm组（ F=6.390， P=0.016），3.3~4.7 mm组（ F=5.630， P=0.023），5.7~7.0 mm组（ F=4.150， P=0.048）的差异均有统计学意义，不同粒径间随着粒径增大羰基含量逐渐减小但差异统计学意义（ F=0.560， P=0.650）。 结论:γ辐照与胶原的氧化损伤具有明显的剂量反应关系，随着γ辐照剂量的增加，胶原损伤程度逐渐增加；DBM的粒径大小影响着胶原对γ辐照的敏感度，随着粒径的减小，DBM颗粒更易被γ辐照损伤；辐照保护剂在辐照过程中对胶原有一定程度的保护作用。

目的:比较两种长效促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）在早卵泡期超长方案中对体外受精/卵胞质内单精子注射（ in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）的助孕结局。 方法:回顾性队列研究分析2019年3月1日至2019年7月31日期间在温州医科大学附属第二医院生殖医学中心采用两种不同GnRH-a在早卵泡期超长方案的患者共802例，根据长效GnRH-a的不同分为醋酸亮丙瑞林组（A组）和曲普瑞林组（B组），比较两组患者的临床和实验室结局。结果:两组患者年龄、不孕年限、体质量指数（body mass index， BMI）、基础性激素水平、不孕类型，促性腺激素（gonadotropin，Gn）启动日性激素水平、Gn使用时间及总量、降调节时间、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）注射日雌二醇水平及子宫内膜厚度、移植胚胎数、临床结局、治疗总费用，以及因内膜厚度不均、孕酮升高、胚胎质量问题、个体因素而取消移植率等比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）。但B组窦卵泡计数（antral follicle count，AFC）（19.59±7.93）、获卵数［（15.39±7.59）枚］、受精数［（11.20±6.53）枚］、卵裂数［（10.85±6.42）枚］、第3日优质胚胎数［（3.01±2.66）枚］、囊胚数［（5.27±4.02）枚］大于A组［17.68±7.23、（13.70±6.94）枚、（9.50±5.43）枚、（9.26±5.34）枚、（2.57±2.33）枚、（4.49±3.40）枚］（ P=0.001 ， P=0.002 ， P<0.001 ， P=0.001 ， P=0.017 ， P=0.007）。A组hCG注射日黄体生成素（luteinizing hormone，LH）［（0.78±0.64）IU/L］、孕酮水平［（0.72±0.39）μg/L］高于B组［（0.55±0.30）IU/L、（0.64±0.36）μg/L］（ P<0.001 ， P=0.005），A组为防止卵巢过度刺激综合征 （ovarian hyperstimulation syndrome， OHSS）的发生取消移植率［28.52%（75/263）］高于B组［14.95%（16/107）， P=0.006］。 结论:两种长效GnRH-a药物应用于早卵泡期超长方案均可获得满意的降调节效果、实验室及临床结局，但醋酸亮丙瑞林对垂体抑制相对温和，相比较于曲普瑞林获得的临床妊娠率有升高趋势。

目的:探究褐藻寡糖(AOS)对慢性不可预知温和应激(CUMS)模型斑马鱼抑郁样行为及肠道菌群的影响.方法:将野生型AB品系斑马鱼随机分为正常组、模型组、阳性对照组和AOS低、中、高剂量(AOS-L、AOS-M、AOS-H)组,每组24尾.除正常组外,其余各组均接受14d的CUMS建立斑马鱼抑郁样模型.除正常组和模型组给予等体积饲养水外,其余各组于第8天开始每天浸泡60 min相应浓度的AOS.14 d后,采用新型水箱测试(NTT)和明暗箱测试(LDB)进行行为实验,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测脑组织中5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)水平,16s rRNA测序检测肠道菌群变化.结果:与模型组比较,在NTT中,阳性对照组和AOS-H组斑马鱼第1次进入顶部潜伏期显著缩短,在顶部的时间显著延长,进入顶部的次数显著增加(均P＜0.01),活动范围扩大.与模型组比较,在LDB中,阳性对照组和AOS-H组斑马鱼第1次进入光亮区域的潜伏期显著缩短,AOS-M组和AOS-H组在光亮区域的持续时间显著延长,阳性对照组和AOS各剂量组进入光亮区域的次数显著增加(P＜0.05或P＜0.01).与正常组比较,模型组体质量指数、5-HT和NE水平显著降低(P＜0.01).与模型组比较,AOS-M组、AOS-H组体质量指数显著增加(P＜0.05或P＜0.01);阳性对照组和AOS-H组5-HT水平显著提高(P＜0.01).AOS可以提高肠道菌群丰富度和多样性,调节群落组成结构.在门水平上,调节变形菌门、放线菌门、梭杆菌门和厚壁菌门等菌门的相对丰度.在属水平上,调节鲸杆菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、未分类根瘤菌属和根瘤菌属菌群等菌属的相对丰度.影响肠道中碳代谢、嘌呤代谢和丙酮酸代谢等代谢功能及相关物质转运过程.结论:AOS能改善CUMS斑马鱼抑郁样行为,增加体质量指数,其作用与调节神经递质、肠道菌群组成及其代谢和物质转运功能有关.

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的发生、发展与细胞焦亡有一定关系,其中炎症小体核苷酸结合寡聚结构域,富含亮氨酸重复序列和含Pyrin结构域3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)和人黑色素瘤缺乏因子、炎症因子重组人白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及与炎症小体相关的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apop-tosis associated speck like protein containing CARD,ASC)等是主要的影响因素.在能够保证"骨稳态"的基础上,从中医学气血、经络理论探讨调控细胞焦亡的作用机制,相对温和地采用中医药可以有效延缓 KOA的疾病进展.中医药主要通过调控caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-18、IL-1β等相关表达抑制细胞焦亡.目前具体的机制研究以中药复方实验多见,中药单体及中药活性成分的研究较少,针灸、手法等方面的研究也相对薄弱.未来可基于中医药调控细胞焦亡的基础实验,深入探讨与KOA主要炎症因子相关的预防和治疗,为临床诊治提供新的思路和方案.

背景:目前,对于体外生殖培养液的质量控制文件或技术标准中,对成分含量指标及检测方法未做明确规定,为保证该类产品的安全有效性,应及早建立质量标准.目的:采用液相质谱联用法检测体外生殖培养液中18种氨基酸指标成分,分析不同用途培养液中18种氨基酸的含量.方法:采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法,检测体外生殖培养液中 18 种氨基酸(甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸、胱氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸)指标成分,色谱柱为SUPELCO Discovery HS F5-3(15 cm× 2.1 mm,3 μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱,流速0.35 mL/min,柱温40 ℃;质谱采用电喷雾离子源,负离子模式扫面,扫描方式为多反应监测.结果与结论:18种氨基酸在0.25-12.5 mmol/L浓度范围内线性关系练好;18种氨基酸的平均加样回收率在86.3%-125.3%之间,精密度实验与重复性实验的相对标准偏差均小于4.7%,说明采用液相质谱联用法检测体外生殖培养液灵敏、快速、准确、专属性强,可为体外生殖培养液的质量标准研究提供依据.

在人类积极的土地利用调控下(植树造林),研究景观格局变化对城乡热场环境的影响,可为今后的城市造林工程建设与优化提供参考,并为未来景观格局与热场环境的相关研究提供新视角.本研究以北京平原区百万亩造林项目为背景,运用遥感技术和地理信息系统,利用矩阵转移及耦合分析,评估平原造林对城市热场环境的实际作用,探究因城市造林工程引起的景观格局变化与城市地表温度变化的相关关系.结果表明:北京平原造林工程后,森林和公园的面积比例分别增加了7.6％和0.5％;平原区有19.2％区域热场强度降低,其中,城郊有23.3％区域的热场强度减弱,但仍有23.5％的城市区域存在热场增强的情况;在城乡尺度上,森林和公园面积比例、森林和湿地的平均斑块面积(MPS)与地表亮温(LST)变化呈显著负相关;在城市市区,森林的面积加权平均形状指数(AWMSI)与LST变化呈显著正相关;在城郊区域,森林的MPS和AWMST与LST变化均呈显著负相关,而公园则相反.北京实施平原造林工程后,增加的城市森林和公园对城市热场的缓解有一定作用,但范围有限,主要集中在城郊区的造林点周围,且森林与湿地越集中,越有利于热场的缓解;受研究粒度、时相、地形、人类活动等因素影响,土地利用结构调控引起的景观格局变化与地表温度变化之间存在非线性相关.

目的 建立超高效液相色谱法(UPLC)检测水果罐头中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、靛蓝、亮蓝、赤藓红8种合成着色剂.方法 样品经乙醇-氨水溶液离心提取,水浴蒸发浓缩后,用50％甲醇水溶液溶解定容,过滤,采用UPLC法进行检测.色谱条件:使用SB C18 RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8μm)色谱柱,以甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液为流动相,梯度洗脱,流速为0.3 ml/min,柱温为30℃.光电二极管阵列(PDA)检测器检测,检测波长为230 nm～ 640 nm,各组分的定值波长柠檬黄为428 nm,日落黄为483 nm,靛蓝和亮蓝为608 nm,胭脂红、苋菜红、诱惑红和赤藓红为529 nm.结果 8种合成色素在0.1μg/ml～10.0 μg/ml均有良好的线性关系,相关系数(r) ＞0.999,方法的检出限为0.10 mg/kg～0.30 mg/kg,回收率为93.7％ ～ 104.6％,相对标准偏差为2.03％ ～ 4.36％.结论 该方法操作简便,灵敏度高,结果可靠.

目的 在大肠杆菌中表达重组人白血病抑制因子(HLIF)蛋白,并探索其高效表达的条件.方法 将HLIF重组质粒转化至大肠杆菌BL21,分别给予不同诱导时间(4、8、12、16、20、24 h)、不同浓度大肠杆菌(吸光度值分别为0.5、0.6、0.8、1.0)、不同诱导温度(20、25、30、37、42℃)、不同浓度诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1)、不同浓度乙酸(0.0、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol·L-)进行培养,蛋白电泳考马斯亮蓝染色后,采用Image J软件分析HLIF蛋白的相对表达量,观察不同干预条件对HLIF表达的影响.结果 不同诱导时间下HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=22.088,P＜0.05),诱导16 h时的HLIF蛋白相对表达量显著高于诱导4、8、12、20、24 h(P ＜0.05).不同浓度(以吸光度值表示)大肠杆菌诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=17.153,P＜0.05);吸光度值为0.8时HLIF蛋白相对表达量显著高于吸光度值为0.5、0.6时(P＜0.05),吸光度值为1.0时与吸光度值为0.8时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).不同温度诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=18.053,P＜0.05),25℃时HLIF蛋白相对表达量显著高于20、30、37、42℃时(P＜0.05).不同浓度诱导剂诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(F=1.181,P＞0.05).不同浓度乙酸诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=27.181,P＜0.05),乙酸浓度为0.00 mmol·L-1时HLIF蛋白相对表达量显著高于乙酸浓度为0.1、0.2、0.3、0.4mmol·L-1时(P＜0.05).结论 成功在大肠杆菌表达了HLIF,并探索出了适合最佳表达的诱导时间、大肠杆菌浓度、诱导温度、诱导剂浓度、乙酸浓度等条件.

[目的]采后柑橘极易受指状青霉 (Penicillium digitatum) 侵染而发生严重的绿霉病腐烂, 生物防治因具有安全、有效、环保等特点近年来备受关注.论文旨在研究荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens) ZX对采后柑橘绿霉病的防治效果, 揭示P.fluorescensZX对P.digitatum可能存在的作用机制.[方法]以"北碚447"锦橙果实为试材, 先分别接种20μL拮抗菌培养液、滤液 (培养液离心后, 上清经0.22μm滤膜过滤) 、菌悬液 (培养液离心后, 菌体用无菌水反复洗涤并用无菌水重悬) 和热杀死液 (培养液高温高压灭菌), 2 h后接种20μL P. digitatum孢子悬浮液 (1×104spores/m L), 所有果实于20oC、90％相对湿度环境下恒温恒湿培养8 d后, 测定果实的发病率和病斑直径;制备柑橘皮培养基, 进行平板抑菌试验, 探索P. fluorescens ZX对P. digitatum孢子发芽情况的影响;采用两板对扣法和生物熏蒸法研究P.fluorescensZX挥发性次级代谢产物的抑菌作用;利用插入式细胞培养皿等分析P.fluorescensZX和P.digitatum之间竞争的营养物质;同时, 测定P.fluorescensZX的生长曲线, 利用结晶紫染色法评估P. fluorescens ZX的生物膜形成能力.[结果]P. fluorescens ZX不同处理液之间对采后锦橙绿霉病的作用效果差异显著, 菌悬液抑菌效果最好, 经菌悬液处理的果实, 发病率和病斑直径分别仅为40.83％和1.78 cm;不论是在柑橘皮固体培养基上对峙培养还是在液体培养基中混合培养, 菌悬液和原液的作用效果较好, 固体平板上, 相对抑制率达到了35％–45％, 液体培养基中, P. digitatum孢子12 h后的发芽率不超过27％;P. fluorescens ZX产生的挥发性物质具有抑菌作用, 经P. fluorescensZX熏蒸处理的锦橙果实, 发病率和病斑直径都显著降低;营养竞争试验结果表明, P. fluorescens ZX能更快速有效地消耗柑橘皮培养基中的营养, 并和P. digitatum竞争葡萄糖、果糖、蔗糖、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、精氨酸和脯氨酸等营养物质;同时, P. fluorescens ZX生命力强, 培养4 h后即进入对数生长期, 约24 h后形成成熟的生物膜.[结论]P. fluorescens ZX可能通过抑制P. digitatum孢子发芽、营养与空间竞争、形成生物膜、产生抑菌物质等方式抑制P.digitatum的生长繁殖, 有效防治采后锦橙绿霉病.