台湾乳白蚁Coptotermes formosanus又称为地下白蚁,它以木质纤维素为主食,是广泛分布于全球的经济害虫.地下白蚁对病原微生物强大的免疫防御能力一直是其生物防治应用的瓶颈之一.植食性昆虫的解毒酶在其消化和免疫调节中起着至关重要的作用.针对具有木质素代谢活性的解毒酶在白蚁肠道免疫过程中氧化还原稳态的调控研究对揭示其肠道免疫机制有重要意义.本研究以金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae为免疫诱导物,基于肠道氧化还原态的微电极检测系统,首次对台湾乳白蚁感染真菌后前肠/唾液腺、中肠及后肠中氧化还原电位的变化进行了描述;并利用RNA干扰技术,抑制了具有木质素代谢活性的乳白蚁漆酶基因Cflac1在感染前后的表达,并确定了 Cflac1在乳白蚁肠道免疫防御真菌过程中对氧化还原稳态维系的重要作用.本研究丰富了白蚁肠道免疫机制的研究内容,为拓宽白蚁防治新靶点及生物防治技术的研发提供了理论支撑.

漆酶能够作用的底物非常广泛,包括木质纤维素等大分子聚合物,且在催化反应时可将该类物质还原成水和其他小分子物质,不会造成二次污染,因此,漆酶素有"绿色催化剂"之称,具有被广泛运用于工业生产中的广阔前景.对游离漆酶进行固定化处理能够使其进一步适应工业生产中的恶劣环境,提高稳定性、可循环利用率,扩大耐受pH和温度范围.真菌漆酶作为漆酶的重要来源,本文对其性质、生产,以及新型的固定化方法和各个领域的应用进行了概述.

竹黄菌Shiraia sp.的子座或子实体是我国传统中药——竹黄,具有化痰止咳、活血祛风、利湿的功效,其主要活性成分为苝醌类化合物——竹红菌素,竹红菌素具有抗肿瘤、抗病毒的光敏活性.从短穗竹Brachystachyum densiflorum茎秆中分离筛选到1株内生竹黄菌Shiraia sp.S8,其无性菌丝培养可产胞外漆酶.在自然pH、28 ℃、150 r/min振荡摇瓶培养8 d后,胞外漆酶的酶活达1 361 U/L.胞外漆酶粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.0且在pH为6.0～7.0时具有较好的稳定性,108 h后残余酶活为50％.竹黄菌S8菌株胞外漆酶在33.33 μmol/L 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或266.66 μmol/L乙酰丁香酮介导作用下,可使活性蓝19、孔雀石绿和中性红快速脱色,60 min内脱色率分别可达85.06％、88.55％和81.13％.在竹黄菌转录组数据分析的基础上,克隆得到编码漆酶的cDNA序列(lcc1).该cDNA编码的蛋白具备完整的真菌漆酶保守结构域,前18个N末端氨基酸残基为典型信号肽序列,lcc1全长1 785 bp,开放阅读框(ORF)全长1 002 bp,编码594个氨基酸,预测其分子量为6.53×104,pI为6.05.本研究为真菌漆酶的生产提供了新的菌株资源,并为漆酶在染料废水处理上的应用提供了参考.

蜜环菌能为药用真菌伞形多孔菌菌核(猪苓)的生长提供营养,其自身也是一种重要的食药用真菌.筛选优良的蜜环菌菌株既可用于猪苓的栽培生产,也可为蜜环菌的进一步开发提供参考.本研究将从野生猪苓中分离得到的47株蜜环菌菌株划分形态型,选取12个代表性菌株进行液体培养,研究菌丝体多糖含量,以及发酵液中的羧甲基纤维素酶(CMC酶)、木聚糖酶、漆酶的活性变化.结果显示,蜜环菌菌株M8-3生长较快,生物量累积最高,3种关键酶的活性也较高,为较优质菌株,可用于猪苓的栽培实验;菌株M3和M8-3菌丝体多糖含量较高,可作为蜜环菌开发利用的候选菌株.

漆酶主要是由真菌分泌的一类胞外多铜氧化酶,因其具备多功能特性而被广泛地应用于绿色环境化学.漆酶能够以分子氧作为电子接受体,催化氧化多种酚类和非酚类底物形成自由基中间体,随后这些自由基中间体涉及到氧化耦合或键断裂,最终导致底物发生氧化、分解或聚合反应.目前,主要采用包埋、吸附、共价绑定和交联结合等方法制备固定化漆酶,以增强漆酶在实际环境中的催化活性、稳定性和循环再利用功效.概述了真菌漆酶的分子组成、结构特性及其催化氧化不同底物的作用机理,系统地比较了漆酶的固定化技术及其利弊,重点阐述了漆酶在有机污染物去除、合成染料脱色、造纸废水、食品加工、生物传感器和环境质量指示器等领域的研究进展,旨在为拓展和开发真菌漆酶在绿色环境化学中的多功能应用提供新的理论依据和指导思想.

以先前筛选到的高产漆酶黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)为模板,利用同源克隆技术合成一个全长为1680 bp的漆酶基因,核苷酸及氨基酸序列比对显示该基因与真菌漆酶基因有较高的同源性,将其命名为lac1680,将该基因连接到构建好的pET24a载体上,并转入表达菌株BL21 Escherichia coli(DE3)中,经对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测,获得75 kD目的条带,表明诱导表达成功.随后利用NI-NTA层析柱对洗脱下来的lac1680蛋白进行纯化,纯化回收后,漆酶纯度可达98％ 以上.通过对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生菌株不同培养时间产酶活力,结果表明构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了近39％.

虽然真菌能够分泌漆酶从木质素中获取碳源,然而纯化后真菌漆酶降解木质素的能力却极低.本文利用萃取方法提取刺芹侧耳栽培料及菌体中可溶性化合物,通过快速漆酶介体体系(LMS)动力学实验确定其对漆酶催化氧化反应的促进或抑制能力,进一步利用HPLC-MS和代谢组学差异分析的方法从最高活性萃取液的柱层析组分中挖掘潜在的活性成分.研究结果表明栽培料中可能含有活性介体成分,生物信息学XCMS代谢产物组分析揭示了CTE05分离组分中富含的木质素代谢产物,涉及到软木脂单体合成、香豆素合成、丁香油酚或异丁香油酚合成、质体醌醇合成、由苯丙氨酸合成硫代葡萄糖苷和安息香酸合成等代谢途径.最后讨论了其中11种潜在的天然介体分子物理化学性质,其中4种为已有文献报道的天然介体小分子.本研究暗示木质素降解与合成代谢在分子机制上存在有某种联系,相关的代谢产物可能参与了真菌降解木质素的代谢过程.

[背景]漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)是木质素降解的主要酶,二者有协同效应.Mnp活性依赖于Mn2+,而Mn2+是大多数漆酶的抑制剂.[目的]获得耐Mn2+的细菌漆酶用于木质素降解.[方法]构建许昌市某污水河污泥宏基因组文库,通过活性筛选获得细菌漆酶基因lac1542.使用大肠杆菌异源表达Lac 1542,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并进一步检测了含Lac 1542复合酶系降解木质素能力.[结果]测序结果显示lac1542编码一个含513个氨基酸的蛋白.以ABTS为底物Lac1542最适反应pH为4.0,在pH 3.0-6.5范围内酶活性稳定.最适反应温度是75℃,在70℃以下酶活性稳定;100 mmol/L的Mn2+仍能提高酶的活性.动力学参数研究发现,该酶的最适底物顺序为:ABTS＞丁香醛联氮＞儿茶酚＞2,6-DMP＞愈创木酚.Lac 1542/Mnp复合酶系对木质素降解率为47.8％,比单独使用Mnp木质素降解率(22.4％)提高25.4％. Lac1542/Mnp/灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase,CIP)复合酶系木质素降解高达71.5％,比Mnp/CIP酶系木质素降解率(48.9％)提高22.6％,加入Lac1542后的复合酶系能明显提高木质素的降解率.[结论]Lac1542的可溶性表达、耐受高浓度Mn2+、热稳定性使得Lac1542可以替代一些经典的真菌漆酶应用于制浆、造纸、纤维素乙醇生产、染料脱色等工业.

白腐真菌是一类降解木质素使木材形成白色腐朽的担子菌,往往具有高产胞外漆酶的活性. 从北京农学院校园内分离到一株高温型、高产漆酶白腐真菌菌株,编号为BUA- 01. 结合形态学特征与ITS序列分析,确定其分类学地位;进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、碳氮比(C/N)、生长因子、最适温度和最适pH值;利用不同浓度Cu2+(CuSO4)的诱导,探讨液体发酵条件下对胞外漆酶产量的影响;通过向发酵液中加入3种偶氮染料(依文思蓝、甲基橙和铬黑T),研究菌株对染料的降解效果. 结果表明,该菌株与毛栓菌(Trametes hirsuta)的同源性最高,为100％,遗传距离为0,确定BUA-01菌株为栓菌属(Trametes)真菌. 菌丝体生长的最适碳源为淀粉,最适氮源为黄豆粉、酵母浸粉,最适C/N值为40/1和10/1,最适温度为37 ℃,最适pH为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用. 0.25 mmol/L的Cu2+对胞外漆酶产量有极显著的促进作用,在96 h时,发酵液的活性达到最高,为1081.33 ± 6.3 U/mL,是对照组的26倍. BUA-01菌株对偶氮染料降解效果显著,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31％ ± 0.16％、92.37％ ± 0.42％和79.25％ ± 0.64％. 本研究表明菌株BUA-01在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值. (图3 表7 参42)

本研究通过含亚甲基蓝染料的固体培养基,从19株白腐真菌菌株中分离获得3个脱色能力较强的菌株,其在平板上的脱色圈大小分别为7.5cm、6.8cm和5.5cm.鉴定其为:云芝栓孔菌Trametes versicolor(ZT-197),绒毛栓孔菌Trametes pubescens (ZT-230)和亚黑管孔菌Bjerkandera fumosa(ZT-307).其中,ZT-230对染料亚甲基蓝的脱色能力最强,可以将染料浓度为50mg/L的100mL液体培养基在6d之内100％脱色,而ZT-197和ZT-307在接种第10天时的脱色率为98％和80％.同时测定了3株白腐真菌在降解染料过程中的漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶3种酶活力的规律:ZT-197和ZT-230均可分泌Lac和MnP两种酶,ZT-307只分泌LiP.本研究说明绒毛栓孔菌ZT-197在印染废水治理方面具有较好的应用前景.