菌株 2-1-1 于贵州大学校园樱花树干子实体中分离,通过形态学结构、ITS 序列及系统发育树分析,鉴定其为白囊耙齿菌Irpex lacteus,对菌株 2-1-1产生的 3种木质素降解酶进行测定,发现菌株可分泌漆酶(laccase,Lac)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)和锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP).利用菌株 2-1-1 对固体培养基条件下 7 种染料的脱色能力进行检测,筛选出较易脱色的刚果红染料,同时采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS)分析确定经白囊耙齿菌降解的刚果红染料代谢产物,并对其进行脱色条件优化和毒力测验,试验分析表明:菌株 2-1-1 对 7 种染料均有脱色,对刚果红脱色效果较佳.GC-MS分析刚果红染料降解产物主要为联苯胺、联苯、苯乙烯、十六烷和3-硝基苯酚.单因素和综合优化脱色条件:染料浓度 50 mg/L,碳源为果糖、金属离子为锌离子、pH 7,该条件下刚果红染料脱色效果最优.优化条件下菌株 2-1-1 对刚果红染料脱色率达 91.03%,相比对照组脱色率提高 17.13%,刚果红染料经菌株 2-1-1 脱色前后毒力测试:染料原液>脱色后>清水处理,表明该菌株可降低刚果红染料毒性.

偶氮染料广泛应用于纺织、造纸和包装等行业,因其具有三致性、结构稳定且难降解,已成为染料废水处理的研究热点之一.本研究以白腐真菌作为脱色菌株,考察了不同白腐真菌对偶氮类染料酸性橙 7(acid orange 7,AO7)的脱色降解,探讨了AO7 染料的浓度、pH、温度以及脱色时间对染料脱色率的影响,同时应用紫外-可见光谱吸收法、红外光谱吸收法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法对AO7 的降解产物进行分析,并对其产物进行植物毒性实验,以推断AO7 可能的降解途径及其降解产物的毒性.结果表明:在pH 4.5、28℃条件下,刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)和杂色云芝(Trametes versicolor)的混合菌丝脱色降解 100 mg/L AO7,24 h脱色率可达 93.46%.推测 AO7 可能的生物降解途径:AO7 偶氮键断裂生成对氨基苯磺酸和 1-氨基-2-萘酚;接着对氨基苯磺酸脱去磺酸基,生成对苯二酚;同时 1-氨基-2-萘酚开环生成邻苯二甲酸和对羟基苯甲醛,之后进一步降解生成苯甲酸;最后对苯二酚和苯甲酸继续氧化成其他小分子中间体、H2O和CO2.植物毒性实验表明,P.eryngii和T.versicolor混合菌丝对AO7 脱毒效果较好.以上研究为探究白腐真菌在工业废水中降解偶氮类染料的应用奠定基础.

通过对福建省龙海市海门岛红树林保护区的近海沉积物样品进行富集驯化,得到了能够协同降解偶氮染料活性黑5的混合菌群HMD9-Q7.经过生化试验和16S rDNA序列分析,鉴定该混合菌群主要由越南蔷薇菌(Rossellomorea vietnamensis)、转化异源物食烷菌(A lcanivorax xenomutans)和近海生微泡菌(Microbulbifer maritimus)组成.与单一菌株相比较,混合菌群具有显著的脱色效果,可能因其菌株之间存在着相互协同促进作用.该混合菌群对含20～100 mg/L浓度的活性黑5均产生脱色作用.混合菌群HMD9-Q7可以广泛利用外加碳源和氮源,如葡萄糖、硝酸铵、牛肉膏等;NaCl浓度在5～30 g/L范围内都可对活性黑5进行脱色;在pH 7和温度30℃条件下脱色率最高.在最优条件下,该混合菌群在60 h内对活性黑5的脱色率可达到85％～90％.该新型混合菌群主要通过生物降解途径来实现对活性黑5的脱色.随着降解反应的发生,活性黑5的最大吸收峰逐渐变小直至完全消失,降解产物吸收峰位于近紫外光区.

竹黄菌Shiraia sp.的子座或子实体是我国传统中药——竹黄,具有化痰止咳、活血祛风、利湿的功效,其主要活性成分为苝醌类化合物——竹红菌素,竹红菌素具有抗肿瘤、抗病毒的光敏活性.从短穗竹Brachystachyum densiflorum茎秆中分离筛选到1株内生竹黄菌Shiraia sp.S8,其无性菌丝培养可产胞外漆酶.在自然pH、28 ℃、150 r/min振荡摇瓶培养8 d后,胞外漆酶的酶活达1 361 U/L.胞外漆酶粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.0且在pH为6.0～7.0时具有较好的稳定性,108 h后残余酶活为50％.竹黄菌S8菌株胞外漆酶在33.33 μmol/L 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或266.66 μmol/L乙酰丁香酮介导作用下,可使活性蓝19、孔雀石绿和中性红快速脱色,60 min内脱色率分别可达85.06％、88.55％和81.13％.在竹黄菌转录组数据分析的基础上,克隆得到编码漆酶的cDNA序列(lcc1).该cDNA编码的蛋白具备完整的真菌漆酶保守结构域,前18个N末端氨基酸残基为典型信号肽序列,lcc1全长1 785 bp,开放阅读框(ORF)全长1 002 bp,编码594个氨基酸,预测其分子量为6.53×104,pI为6.05.本研究为真菌漆酶的生产提供了新的菌株资源,并为漆酶在染料废水处理上的应用提供了参考.

利用海藻酸钙法对乳白耙齿菌进行固定化,检测固定化乳白耙齿菌(固定化菌)对几种染料的脱色能力.同时,考察pH值、染料浓度、金属离子、碳源种类、氮源种类、盐浓度对固定化菌脱色茜素红的影响.结果表明,固定化菌的优化条件为海藻酸钠3％、氯化钙5％、固定化时间6h、接菌量10g/100mL;固定化菌对6种染料均可脱色,其中对茜素红染料的脱色效果最为明显;固定化菌对茜素红的脱色率随染料浓度的增加而下降,当染料浓度高于250mg/L时,其脱色效果明显下降;固定化菌对茜素红脱色的适宜pH为7,适宜碳源为可溶性淀粉、适宜氮源为硝酸铵.另外,固定化菌对茜素红的脱色率随盐浓度的升高,呈下降趋势,当盐浓度高于3％时,脱色率下降明显;固定化菌于生理盐水中保存10d后,脱色率维持在较高水平,达94.20％;固定化菌重复利用5次后,脱色率仍高达88.70％.

漆酶主要是由真菌分泌的一类胞外多铜氧化酶,因其具备多功能特性而被广泛地应用于绿色环境化学.漆酶能够以分子氧作为电子接受体,催化氧化多种酚类和非酚类底物形成自由基中间体,随后这些自由基中间体涉及到氧化耦合或键断裂,最终导致底物发生氧化、分解或聚合反应.目前,主要采用包埋、吸附、共价绑定和交联结合等方法制备固定化漆酶,以增强漆酶在实际环境中的催化活性、稳定性和循环再利用功效.概述了真菌漆酶的分子组成、结构特性及其催化氧化不同底物的作用机理,系统地比较了漆酶的固定化技术及其利弊,重点阐述了漆酶在有机污染物去除、合成染料脱色、造纸废水、食品加工、生物传感器和环境质量指示器等领域的研究进展,旨在为拓展和开发真菌漆酶在绿色环境化学中的多功能应用提供新的理论依据和指导思想.

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质.重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1390 U/L.纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8.在pH 9.0放置10d活性没有下降,在70℃保温10h后仍保留36％的酶活.Al3+、Fe3+和Mn2+完全抑制漆酶活性.在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6h的脱色率达到了90％以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理.

[背景]漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)是木质素降解的主要酶,二者有协同效应.Mnp活性依赖于Mn2+,而Mn2+是大多数漆酶的抑制剂.[目的]获得耐Mn2+的细菌漆酶用于木质素降解.[方法]构建许昌市某污水河污泥宏基因组文库,通过活性筛选获得细菌漆酶基因lac1542.使用大肠杆菌异源表达Lac 1542,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并进一步检测了含Lac 1542复合酶系降解木质素能力.[结果]测序结果显示lac1542编码一个含513个氨基酸的蛋白.以ABTS为底物Lac1542最适反应pH为4.0,在pH 3.0-6.5范围内酶活性稳定.最适反应温度是75℃,在70℃以下酶活性稳定;100 mmol/L的Mn2+仍能提高酶的活性.动力学参数研究发现,该酶的最适底物顺序为:ABTS＞丁香醛联氮＞儿茶酚＞2,6-DMP＞愈创木酚.Lac 1542/Mnp复合酶系对木质素降解率为47.8％,比单独使用Mnp木质素降解率(22.4％)提高25.4％. Lac1542/Mnp/灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase,CIP)复合酶系木质素降解高达71.5％,比Mnp/CIP酶系木质素降解率(48.9％)提高22.6％,加入Lac1542后的复合酶系能明显提高木质素的降解率.[结论]Lac1542的可溶性表达、耐受高浓度Mn2+、热稳定性使得Lac1542可以替代一些经典的真菌漆酶应用于制浆、造纸、纤维素乙醇生产、染料脱色等工业.

白腐真菌是一类降解木质素使木材形成白色腐朽的担子菌,往往具有高产胞外漆酶的活性. 从北京农学院校园内分离到一株高温型、高产漆酶白腐真菌菌株,编号为BUA- 01. 结合形态学特征与ITS序列分析,确定其分类学地位;进一步研究其菌丝生长的最适碳源、氮源、碳氮比(C/N)、生长因子、最适温度和最适pH值;利用不同浓度Cu2+(CuSO4)的诱导,探讨液体发酵条件下对胞外漆酶产量的影响;通过向发酵液中加入3种偶氮染料(依文思蓝、甲基橙和铬黑T),研究菌株对染料的降解效果. 结果表明,该菌株与毛栓菌(Trametes hirsuta)的同源性最高,为100％,遗传距离为0,确定BUA-01菌株为栓菌属(Trametes)真菌. 菌丝体生长的最适碳源为淀粉,最适氮源为黄豆粉、酵母浸粉,最适C/N值为40/1和10/1,最适温度为37 ℃,最适pH为6.0-7.0,供试生长因子对菌丝生长无显著促进作用. 0.25 mmol/L的Cu2+对胞外漆酶产量有极显著的促进作用,在96 h时,发酵液的活性达到最高,为1081.33 ± 6.3 U/mL,是对照组的26倍. BUA-01菌株对偶氮染料降解效果显著,12 h对依文思蓝、甲基橙和铬黑T的脱色率分别为93.31％ ± 0.16％、92.37％ ± 0.42％和79.25％ ± 0.64％. 本研究表明菌株BUA-01在产胞外漆酶和染料降解方面具有潜在应用价值. (图3 表7 参42)

从刚果红染料中分离到一株刚果红高效脱色菌,经16S rRNA基因序列(NCBI accession No.KY655213)鉴定,该菌株属于类芽孢杆菌(Paenibacillus),将该菌株命名为Paenibacillus dendritiformis GGJ7(简写为GGJ7).将其运用于偶氮染料脱色,并研究不同营养条件、不同培养条件(温度、pH、溶解氧)和不同染料下的脱色性能,结果表明,GGJ7对刚果红脱色效果远高于以前工作中分离到的YRJ1、YRJ2等8株同样具有脱色功能的细菌;该菌株脱色的最佳条件为30℃、pH 7、25 g/L LB培养基厌氧培养;其脱色机理以生物降解为主,且脱色过程符合一级反应动力学方程:-ln (At/A0)=0.6058t-0.1082.经测试,GGJ7对多种偶氮染料的脱色率高达95％,其中50 mg/L甲基橙、25 mg/L藏花猩红和25 mg/L甲基红仅需lh,50 mg/L橙黄G和50 mg/L橙黄G6仅需3h,50 mg/L刚果红仅需4h.可见GGJ7是一株高效偶氮染料脱色菌,具有处理印染废水的开发应用潜能.